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蛋白检测
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文献和实验【原创】暗室实验(化学发光底物检测方法)及Western Blot实验优化方法
有多少种不同稀释浓度。通常,一种或两种一抗的稀 释度是用两种或三种不同的二抗稀释度进行测定的。例如:1/1000 的一抗和1/50000 的二抗;1/1000 的一抗和1/100000 的二抗;1/5000 的一抗和1/50000 的二抗;以及1/5000 和1/100000 的二抗。 3. 将膜放在滤纸上。将抗原稀释液点在膜上。用尽可能小量的稀释液点在膜上(2-5 ul 为宜),因为用的体积越大,信号越弥散。抗原溶液在膜上干10-30 分钟或直至无可见的水分。 4. 用含0.05
重要。1.转膜时间2. 转膜过程环境温度3. 转膜缓冲液使用次数4.转膜缓冲液中甲醇比例(v/v)(三)一抗使用*使用IRS1(150kDa)、pPERK(125kDa)和内质网应激XBP1(29/55kDa)抗体等检测小鼠肝组织探讨一抗在多种条件下对结果影响(IRS1,pPERK和 XBP1 用于 WB 检测难以出现清晰条带,因此选择合适的一抗及孵育条件就很关键)。1.一抗稀释溶剂2.一抗稀释比例3.一抗孵育时间(四)二抗使用*高浓度的二抗会导致大量非特异性结合,造成WB背景较深。1.二抗稀释比例 (洗释
使用寿命(抗体并非绝对不可以冻融;只是高浓度的原始管抗体的冻融对效价会有较大影响)。抗体稀释液(一抗、二抗稀释液也可同也可不同)和封闭液可以相同,可以不同,因为抗体稀释液可以采用复方的,所以即使混合了少许,不会对抗体的使用产生较大的影响。不过封闭液用milk时,gelatin稀释的一抗混入少许milk会影响其使用寿命。由于以上诸多可变因素,实在无法总结出一种万金油式的抗体稀释液(只能是多数通用),因此对待具体问题时,请具体对待(多花点心思摸索吧)。
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