血液尿激酶（UROKINASE）活性比色法定量检测试剂盒

尿激酶（urokinase；UK；EC3.4.21.73），又称为尿激酶型纤维蛋白溶酶原激活剂（urokinase-type Plasminogen Activator；uPA），属于丝氨酸蛋白酶，存在于血液、细胞外基质和尿液中。尿激酶由411氨基酸构成，分子量为54KD，有3个结构域：丝氨酸蛋白酶结构域、kringle结构域和生长因子结构域。其主要的生理性底物为纤维蛋白溶酶原（Plasminogen），即纤维蛋白溶酶（plasmin）的酶原形式（zymogen），切离部位为 Cys-Pro-Gly-Arg⊥Val -Val-Gly-Gly-Cys。一旦切离后激活，纤维蛋白溶酶参与细胞蛋白水解过程，包括血栓溶解（thrombolysis）和细胞外基质降解等。尿激酶与组织重构、修复、血管形成（angiogenesis）性疾病和肿瘤扩散有关。尿激酶的抑制剂是丝氨酸蛋白酶抑制剂（serpins），即纤维蛋白溶酶原激活剂抑制剂
（Plasminogen Activator Inhibitor；PAI）。基于人工合成的三肽化合物底物p-EGR-pNA（pyro-Glu-Gly-Arg-p- Nithoaniline；焦谷氨酸酰甘氨酰精氨酰对xiao基苯胺）受到尿激酶的水解，释放有色对xiao基苯胺，在分光光度仪（405nm 波长）下，测定吸光峰值的变化，来定量测定尿激酶的活性。尿激酶反应系统为：

产品内容

HEPENGBIO 缓冲液（Reagent A） 毫升
HEPENGBIO 阴性液（Reagent B） 毫升
HEPENGBIO 底物液（Reagent C） 微升
产品说明书 1 份

保存方式

保存在-20℃冰箱里；HEPENGBIO 底物液（Reagent C）避免光照和反复冻融；

用户自备

1.5 毫升离心管：用于样品制备和储存的容器微型台式离心机：用于样品操作
培养箱：用于反应物孵育
酶标板或比色皿：用于样品比色测定的容器酶标仪或分光光度仪：用于样品比色分析

实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的 HEPENGBIO 底物液（Reagent C）置入冰槽里融化，避免光照。然后进行下列操作。

一、 样品制备

选择一：血浆样品

1. 准备好 ACD 抗凝管
2. 抽取 1 毫升血液，置于抗凝管里
3. 放进 4℃微型台式离心机离心 10 分钟，速度为 700g（或 3000RPM，例如 eppendorf 5415）
4. 小心移取上层黄色液体到新的 1.5 毫升离心管――此为血浆成分（注意：避免触碰白色液体层）
5. 即刻置于冰槽里备用或放进－70℃冰箱里保存
6. （选择步骤）移取 10 微升进行蛋白定量测定 （注意：建议使用 HEPENGBIO Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒－HEPENGBIO30030.1）

选择二：血清样品

1. 准备好不含抗凝剂的储存管
2. 抽取 1 毫升血液，置于储存管里
3. 室温下，静置 30 分钟，直至血液凝结
4. 放进 4℃微型台式离心机离心 15 分钟，速度为 2000g（或 5000RPM，例如 eppendorf 5415）
5. 小心移取上层黄色液体到新的 1.5 毫升离心管――此为血清成分（注意：避免触碰白色液体层）
6. 即刻置于冰槽里备用或放进－70℃冰箱里保存
7. （选择步骤）移取 10 微升进行蛋白定量测定 （注意：建议使用 HEPENGBIO Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒

1. 准备好上述制备的待测样品
2. 设定好酶标仪（温度为 37℃）：波长 405nm，并置零三、 活性测定

1. 在 96 孔酶标板上做好相应标记：背景对照和样品
2. 分别移取 xx 微升 HEPENGBIO 缓冲液（Reagent A）到相应孔中
3. 分别加入 xx 微升 HEPENGBIO 阴性液（Reagent B）或上述制备的待测样品（50 微克蛋白）到相应孔中

（注意：样品须清澈）

1. 分别加入 xx 微升 HEPENGBIO 底物液（Reagent C）
2. 轻轻摇动 96 孔酶标板（注意：避免气泡）