RNAmisi microRNA快速提取试剂盒

目录号: RN05

适用于快速提取各种细胞组织 miRNA 和其它各种小 RNA

本试剂盒按照指示储存 6 个月不影响使用效果。

储存事项

1. Wash Solution 1 和 Wash Solution 2/3 加入无水乙醇后，可常温保存一个月；如需更长时间保存，需放 4℃，但使用前应先回复到室温。
2. Wash Solution 2/3 加入乙醇使用几天后可能出现沉淀晶体，不影响使用，直接不吸晶体、吸上清即可。
3. 运输在常温下进行，不影响使用效果。
4. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH 变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

◆ 产品介绍：

◆ 产品特点：

1. 离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特吸吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
2. 也不需要乙醇沉淀等容易丢失微小分子 RNA 的步骤。
3. 快速，简捷，单个样品操作一般可在 30 分钟内完成。
4. 多次柱漂洗确保高纯度，OD₂₆₀/OD₂₈₀典型的比值达 1.9~2.0，基本无 DNA 残留，可用于 RNAi、RT - PCR、Northern - blot 和各种实验。

◆ 注意事项

1. 第一次使用前请先在 70% 乙醇、Wash Solution 1 瓶和 Wash Solution 2/3 瓶中加入指定量乙醇，加入后请及时打钩标记已加入乙醇，以免多次加入！
2. 所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到 13，000 rpm 的传统台式离心机，如 Eppendorf 5415C 或者类似离心机。
3. 需要自备乙醇，氯仿，一次性注射器，研钵。
4. Lysis/Binding buffer 和 Wash Solution 1 含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。
5. 预防 RNase 污染，应注意以下几方面：
   1. 经常更换新手套。因为皮肤经常带有细菌，可能导致 RNase 污染。
   2. 使用无 RNase 的塑料制品和枪头避免交叉污染。
   3. RNA 在裂解液中时不会被 RNase 降解。但提取后继续处理过程中应使用不含 RNase 的塑料和玻璃器皿。玻璃器皿可在 150℃烘烤 4 小时，塑料器皿可在 0.5M NaOH 中浸泡 10 分钟，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除 RNase。
   4. 配制溶液应使用无 RNase 的水。（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入 DEPC 至终浓度 0.1%(v/v)，37℃放置过夜，高压灭菌。）
6. RNA 纯度及浓度检测：
   • 完整性：RNA 可用普通琼脂糖凝胶电泳（电泳条件：胶浓度 1.2%，0.5×TBE 电泳缓冲液；150v，15 分钟）检测完整性。由于细胞中 70%~80% 的 RNA 为 rRNA，电泳后 UV 下应能看到非常明显的 rRNA 条带，动物 rRNA 大小分别为 5kb 和 2kb，分别相当于 28S 和 18S rRNA，动物 RNA 样品中最大 rRNA 亮度应为次大 rRNA 亮度的 1.5 - 2.0 倍，否则表示 RNA 样品的降解。出现弥散片状或条带消失表明样品严重降解。
   • 纯度：OD₂₆₀/OD₂₈₀比值是衡量蛋白质污染程度的指标。高质量的 RNA，OD₂₆₀/OD₂₈₀读数（10mMTris，pH7.5）在 1.8 - 2.1 之间。OD₂₆₀/OD₂₈₀读数受测定所用溶液的 pH 值影响。同一个 RNA 样品，假定在 10mM Tris，pH7.5 溶液中测出的 OD₂₆₀/OD₂₈₀读数 1.8 - 2.1 之间，在水溶液中所测读数则可能在 1.5 - 1.9 之间，但这并不表示 RNA 不纯。
   • 浓度：取一定量的 RNA 提取物，用 RNase - free 水稀释 n 倍，用 RNase - free 水将分光光度计调零，取稀释液进行 OD₂₆₀、OD₂₈₀测定，按照以下公式进行 RNA 浓度的计算：终浓度（ng/μl）= (OD₂₆₀)×(稀释倍数 n)×40。

◆ 操作步骤：（提取包含 microRNA 的总 RNA）

1. 组织培养细胞

    

   a. 收集 < 10⁷悬浮细胞到一个 1.5ml 离心管。（对于贴壁细胞，孔板培养和细胞培养可以直接裂解，尽可能吸干所有培养液残留后直接加入 1ml 的 Lysis/Binding buffer，迅速轻摇使 Lysis/Binding buffer 充分和细胞底所有细胞接触裂解细胞并灭活 RNA 酶，轻轻用移液器反复吹打混匀按操作步骤下 3。）

    

   b. 13，000rpm 离心 10 秒（或者 300g 离心 5 分钟），使细胞沉淀下来。完全弃去上清，留下细胞，注意不完全弃去上清会稀释裂解液导致产量纯度降低。

    

   c. 轻弹管壁将细胞沉淀完全松散重悬，加入 1ml Lysis/Binding buffer，涡旋或者吹打，充分裂解混匀。

    

   d. 按操作步骤下 3。
2. 动物组织（例如肝脑）

    

   a. 新鲜组织用解剖刀迅速切成小碎块。根据处理组织的质量，按照 50 - 100mg 加入 1ml 的比例加入 Lysis/Binding buffer 后电动或者手动彻底匀浆。或者在液氮中研磨组织成细粉后，取适量组织细粉（约 50 - 100mg）转入装有 1ml Lysis/Binding buffer 的 1.5ml 离心管中，剧烈吹打涡旋混匀。

    

   b. 可选，一般不需要：如果处理量大有明显颗粒或者不溶物，非常粘稠或者裂解不充分，可立即用带针头的一次性 5ml 的（0.9mm 针头）注射器抽提裂解物 10 次或直到得到满意匀浆结果（或者电动匀浆 30 秒）；可以剪切 DNA，降低粘稠度和提高产量。

    

   c. 按操作步骤下 3。
3. 室温放置 5 分钟以充分分离核酸蛋白复合物。
4. 加入 200μl 氯仿，剧烈振荡 15 秒。
5. 室温放置 2 - 3 分钟，13，000rpm 离心 10 分钟。
6. 小心取上清（约 600μl）转入到新的离心管，加入 1.5 倍体积的无水乙醇（必须是室温的，通常 900μl），涡旋混匀。此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹打混匀，不要离心，立刻接下步。
7. 将混合物（每次小于 700μl，多可以分两次加入）加入一个吸附柱 RA 中，（吸附柱放入收集管中）12，000rpm 离心 30 - 60 秒，弃掉废液。
8. 加 700μl 70% 乙醇（请先检查是否已加入无水乙醇），12，000rpm 离心 30 秒，弃掉废液。
9. 加入 500μl Wash Solution 2/3（请先检查是否已加入无水乙醇），12，000 rpm 离心 30 秒，弃掉废液。加入 500μl Wash Solution 2/3，重复一遍。
10. 将吸附柱 RA 放回空收集管中，13，000 rpm 离心 2 分钟，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
11. 取出吸附柱 RA，放入一个 RNase free 离心管中，根据预期 RNA 产量在吸附膜的中间部位加 30 - 50μl RNase free 水（事先在 100℃水浴中预热效果更好），室温放置 1 分钟，12，000 rpm 离心 1 分钟。
12. 如果预期 RNA 产量 > 30μg，加 30 - 50μl RNase free water 重复步骤 11，合并两次洗脱液；或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍（如果需要 RNA 浓度高）。

     

    洗脱两道的 RNA 洗脱液浓度高，分两次洗脱合并洗脱液的 RNA 产量比前者高 15 - 30%，但是浓度要低，用户根据需要选择。

附：microRNA 富集方法（仅仅提取 microRNA，不包含 > 200 nt 其它总 RNA 成份。）

1. 按照前面标准操作步骤 1 - 5 操作，直到得到上清。
2. 较精确估计上清体积（约 600μl），加入等体积 70% 乙醇（请先检查是否已加入无水乙醇）（必须是室温的），涡旋或者吹打充分混匀，不要离心。
3. 将混合物加入一个吸附柱 RA 中，（吸附柱放入收集管中）12，000 rpm 离心 30 - 60 秒，收集滤过物。将滤过物从收集管转移到一个新的离心管后，把吸附柱子放回空的收集管内，再加入剩下的混合物，离心，收集滤过物。合并两次滤过物，计算体积。
    
   此时，滤过物含有 microRNA，吸附柱子上面是除去了 microRNA 的总 RNA（不包含 microRNA），如果需要，可以按照前面标准操作步骤 8 - 11 操作漂洗，洗脱回收得到去除了 microRNA 的总 RNA。
4. 较精确估计滤过物体积，加入 0.65 倍体积无水乙醇（必须是室温的），涡旋或者吹打充分混匀，不要离心。
5. 取一套新的 microRNA 吸附柱 MA，将上一步骤混合物（每次小于 700μl, 多可以分两次加入）加入 microRNA 吸附柱 MA 中，（吸附柱放入收集管中）12，000 rpm 离心 30 秒，弃掉废液。
6. 按照前面标准操作步骤 8 - 11 操作漂洗，洗脱得到富集的 microRNA。