RNApure 超纯总RNA快速提取试剂盒

RNApure 超纯总RNA快速提取试剂盒

1. 运输和储存均在室温下（15℃-25℃）进行。TRIpure Reagent 可以常温运输，收到后 4℃避光可长期保存，常温保存 3 个月也不影响使用质量。
2. 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH 值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

❖ 产品介绍：
改进的异硫qing酸胍/酚一步法裂解细胞和灭活RNA 酶， 然后总RNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜， 再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤, 去蛋白液和漂洗液将细胞代谢物、蛋白等杂质去除， 最后低盐的RNase free water将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。

❖ 产品特点：
1.离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。
2.结合了异硫qing酸胍/酚一步法试剂稳定性好，纯度高和离心柱方便快捷的优点，不需要异丙醇沉淀和乙醇洗涤过程，RNA可以直接从离心柱上洗脱避免了过度干燥不易溶解问题。
3.独有的RL裂解液配方，可以有效的消除基因组污染。
4.多次漂洗去蛋白过程，提取RNA纯度更高。
5.有效的去除了5S在总RNA中含量，提高了纯度。

1. 本试剂盒抑制 RNA 酶效果良好，所有离心步骤如未加说明，均可在常温进行。
2. TRIpure Reagent 和去蛋白液 PE 中含有刺激性有害化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤、眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。
3. 考虑到环保问题，本试剂盒不含有实验室常用试剂氯仿，使用前需要自备氯仿（或者购买艾德来氯仿替代试剂，货号：RN66）。
4. 常规的琼脂糖凝胶电泳和甲醛变性胶电泳均可以用来分析 RNA 的质量。好的 RNA 产物在变性电泳后应该可以看到明显的二条优势核糖体 RNA 带，分别为～5 Kb（28S），~2 Kb（18S）（注意普通的琼脂糖电泳，28S 和 18S 大约在 2 Kb 和 1 Kb 位置，而且可以随着 RNA 空间二级结构不同，电泳条带所在位置不是固定的），而且亮度比值约为 2:1。有时候也可以看到 0.1 Kb 和 0.3Kb (5S，rRNA) 带。带有信使核糖的植物种类某些植物组织可以看到 4，5 条带也属于正常现象，如果 RNA 未成熟的前体或者不均一核 RNA、小核 RNA 提取出来也可能看到介于 7 Kb 和 15 Kb 之间的不连续的高分子量条带。
5. 检测 OD₂₆₀/OD₂₈₀吸光比值时，如需稀释 RNA 样品应该用 TE（PH 8），如果用水稀释后检测，由于一般水离子强度和 PH 值低，会使 OD₂₆₀升高，从而使比值降低。
6. 加入 TRIpure 匀浆后，加氯仿前，样品可在 - 60℃至 - 70℃保存一个月以上。
7. 若提取细菌 RNA，推荐 EASYspin 系列细菌 RNA 提取试剂盒（目录号：RN43）。

1. 匀浆处理

    

   a. 组织

    

   将组织在液氮中研磨，每 50~100 mg 组织加 1 ml 的裂解液 TRIpure 后匀浆。组织样品容积不能超过 TRIpure 容积的 10%。

    

   b. 单层生长的细胞

    

   直接往直径 3.5 cm 的培养板中加入 1 ml 的 TRIpure 溶解细胞，并用移液枪轻轻吹打混匀。依据培养板的面积而不是依据细胞的数量来决定所需的 TRIpure 量（每 10 cm² 加 1 ml）。一般情况下，普通大小的细胞培养瓶，加入 1 ml 的 TRIpure，迅速轻轻摇晃 TRIpure 充分和瓶底所有细胞接触裂解细胞并灭活 RNA 酶，过程用移液枪反复吹打混匀。当 TRIpure 量不足时可导致抽提的 RNA 中污染有 DNA。

    

   ▲注意：贴壁培养细胞不能完全从培养瓶（皿）脱落，这并不意味着裂解不完全，此时细胞实际已经完全被裂开，并已释放出全部 RNA，继续做即可。

    

   c. 悬浮生长的细胞

    

   通过离心来沉淀细胞，小心弃上清。每 5~10×10⁶的动物细胞，植物细胞加 1 ml 的 TRIpure。在 TRIpure 试剂中用移液枪反复吹打来裂解细胞。在加入 TRIpure 前应避免洗涤细胞，否则会增加 mRNA 降解的可能性。
2. 将匀浆样品剧烈震荡混匀，在 15~30℃条件下孵育 5 min 以使核蛋白体完全分解。
3. 可选步骤:

    

   新的 1.5 ml 的离心管中于 4℃的条件下 12,000 rpm 离心 10 min，小心取上清转入一个 1.5 ml 的离心管中。当样品富含蛋白、脂肪、多糖或是细胞外物质例如肌肉、脂肪组织或植物的块茎部分时可能需要一额外的分离步骤。

    

   匀浆化后在 2~8℃的条件下以 12,000 rpm 离心 10 min，移除匀浆中不溶解的物质，余下的沉淀中包含有细胞外膜、多糖、以及高分子量DNA，
   而上清含有RNA。
4.  每 1 ml TRIpure 加 0.2 ml 氯仿。盖紧样品管盖，剧烈振荡 15 sec 并将其在室温下孵育 2 min。

    

   ▲如果氯仿无法获得，可以购买艾德来的氯仿替代试剂（货号：RN66）

    

   5. 于 4℃ 12,000 rpm 离心 10 min，样品会分成三层：下层有机相，中间层和上层无色的水相，RNA 存在于水相中。水相层的容量大约为所加 TRIpure 体积的 50%，把水相小心转移到新管中（不要触碰中间层），记录水相体积。

    

   6. 加入水相体积一半也就是 0.5 倍体积的无水乙醇，混匀（此时可能会出现沉淀）。将的溶液和可能沉淀一起转入吸附柱 RA 中（吸附柱套在收集管内，若一次不能将全部溶液和沉淀物吸入吸附柱 RA 中，请分两次转入吸附柱 RA 中。），室温（以下步骤均为室温）12, 000 rpm 离心 30 sec，弃废液，将吸附柱重新套回收集管。

    

   7. 加 500 μl 去蛋白液 PE（请先检查是否已加入无水乙醇），12, 000 rpm 离心 30 sec，弃废液。

    

   8. 加 1500 μl 漂洗液 RW（请先检查是否已加入无水乙醇），12, 000 rpm 离心 15 sec，弃废液。

    

   9. 重复步骤 8 一次。

    

   10. 将吸附柱 RA 放回收集管中，12, 000 rpm 离心 2 min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

    

   11. 将吸附柱 RA 转移至新的 1.5 ml 离心管中，向吸附柱中央悬空滴加 50-80 μl 的 RNase-free ddH₂O，静置 2 min，12, 000 rpm 离心 1 min。

    

   ▲洗脱体积建议不少于 30 μl，体积过小会影响核酸回收效率。

    

   ▲以下步骤都可以帮助提高 RNA 产物浓度：

    

   RNase-free ddH₂O 于洗脱前先在 70-90℃预热；

    

   将第一次洗脱液重新加入吸附柱进行第二次洗脱。