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- 2026年01月24日
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1）外周血单个核细胞的分离：取肝素抗凝正常人或者Balb/c小鼠外周血1.5ml。在试管内加入淋巴细胞分离液3ml。将外周血以等体积Hanks液稀释后，轻轻加入淋巴细胞分离液上层。2000g离心20min。取出试管后，轻轻吸取液相交界的单个核细胞，加入Hanks液3ml，混匀后，1500g离心5min。弃去上清，细胞加入0.5ml RPMI 1640培养基（含10% 小牛血清，50 μg/ml penicillin 和50μg/ml steptomycin）重悬，血细胞计数仪计数，调整细胞浓度。
2）不同浓度的PMA刺激后人T淋巴细胞CD4、CD8和CD3的表达。24孔细胞培养板中，每孔加入约5×105个细胞，加入RPMI 1640培养基至总体积1ml。加入不同浓度的PMA（10ng、20ng和50ng终浓度）和500ng/ml Ionomycin共同刺激人外周血单个核细胞，同时加入0.7µl Golgistop，37 ℃ CO2孵箱刺激4h。收集单个核细胞，分为三部分，分别加入CD8-CYC、CD4-CYC、CD3-APC单抗各10μl，室温避光孵育30min。加入红细胞裂解液（FACS Lysing Solution）1ml裂解残余红细胞，2ml PBS洗涤细胞一次。流式细胞仪（FACSCalibur，Becton Dickinson）检测细胞，Cellquest软件获取分析细胞，每个检测获取10000个细胞。采用前向角（FSC）和侧向角（SSC）散射光散点图设门区分淋巴细胞，以直方图分别表示CD3、CD8和CD4阳性淋巴细胞。
3）不同时间PMA和离子霉素刺激后小鼠T淋巴细胞CD4和CD8的表达。24孔细胞培养板中，每孔加入约5×105个细胞，加入RPMI 1640培养基至总体积1ml。加入PMA和Ionomycin使终浓度分别为100ng/ml和1µg/ml，同时加入0.7µl Golgistop。37 ℃ CO2孵箱刺激8h、12h分别收集细胞。采用抗小鼠CD4-CYC、CD8PE抗体标记T淋巴细胞，流式细胞仪检测CD4和CD8的表达。
4）流式细胞术检测人外周血Th1和Th2细胞。分离外周血单个核细胞，加入20ng/ml PMA和500ng/ml 离子霉素刺激4h后，收集细胞。将细胞分为两份，称为对照管和实验管，分别加入CD3-APC，CD8-PercP10µl，混匀，室温放置20min，加入红细胞裂解液1ml，混匀，室温放置10min，1000g离心5min，弃上清。加入Cytofix/Cytoperm液200µl，4℃放置20min，使细胞固定穿孔。加入Perm/Wash液1ml，1500g离心5min，弃上清。实验管加入IFN-γ-FITC、IL-4 - PE各5μl，对照管加入同型对照抗体，4℃避光孵育30min。加入Perm/Wash液500µl洗涤两次。最后以300µl洗涤液重悬细胞。采用FACScom软件及CD3-APC、CD8-PercP 、IFN-γ-FITC、IL-4 – PE抗体单双标记的淋巴细胞调节仪器的补偿，采用Cellquest软件获取分析细胞。以前向角（FSC）和侧向角（SSC）散射光散点图设门区分淋巴细胞，以CD3和CD8散点图设门区分Th细胞（CD3+CD8-）。最终以IFN-γ和IL-4的散点图表示Th1细胞和Th2细胞。
5）流式细胞术检测小鼠外周血Th1和Th2细胞。分离外周血单个核细胞，加入100ng/ml PMA和1µg/ml 离子霉素刺激5h后，收集细胞。将细胞分为两份，称为对照管和实验管，加入CD4－CYC 10µl，混匀，其余步骤同人的检测。调节仪器的补偿，采用Cellquest软件获取分析细胞。以前向角（FSC）和侧向角（SSC）散射光散点图设门区分淋巴细胞，以CD4直方图设门区分Th细胞（CD4+），以IFN-γ和IL-4的散点图表示Th1细胞和Th2细胞。
2）不同浓度的PMA刺激后人T淋巴细胞CD4、CD8和CD3的表达。24孔细胞培养板中，每孔加入约5×105个细胞，加入RPMI 1640培养基至总体积1ml。加入不同浓度的PMA（10ng、20ng和50ng终浓度）和500ng/ml Ionomycin共同刺激人外周血单个核细胞，同时加入0.7µl Golgistop，37 ℃ CO2孵箱刺激4h。收集单个核细胞，分为三部分，分别加入CD8-CYC、CD4-CYC、CD3-APC单抗各10μl，室温避光孵育30min。加入红细胞裂解液（FACS Lysing Solution）1ml裂解残余红细胞，2ml PBS洗涤细胞一次。流式细胞仪（FACSCalibur，Becton Dickinson）检测细胞，Cellquest软件获取分析细胞，每个检测获取10000个细胞。采用前向角（FSC）和侧向角（SSC）散射光散点图设门区分淋巴细胞，以直方图分别表示CD3、CD8和CD4阳性淋巴细胞。
3）不同时间PMA和离子霉素刺激后小鼠T淋巴细胞CD4和CD8的表达。24孔细胞培养板中，每孔加入约5×105个细胞，加入RPMI 1640培养基至总体积1ml。加入PMA和Ionomycin使终浓度分别为100ng/ml和1µg/ml，同时加入0.7µl Golgistop。37 ℃ CO2孵箱刺激8h、12h分别收集细胞。采用抗小鼠CD4-CYC、CD8PE抗体标记T淋巴细胞，流式细胞仪检测CD4和CD8的表达。
4）流式细胞术检测人外周血Th1和Th2细胞。分离外周血单个核细胞，加入20ng/ml PMA和500ng/ml 离子霉素刺激4h后，收集细胞。将细胞分为两份，称为对照管和实验管，分别加入CD3-APC，CD8-PercP10µl，混匀，室温放置20min，加入红细胞裂解液1ml，混匀，室温放置10min，1000g离心5min，弃上清。加入Cytofix/Cytoperm液200µl，4℃放置20min，使细胞固定穿孔。加入Perm/Wash液1ml，1500g离心5min，弃上清。实验管加入IFN-γ-FITC、IL-4 - PE各5μl，对照管加入同型对照抗体，4℃避光孵育30min。加入Perm/Wash液500µl洗涤两次。最后以300µl洗涤液重悬细胞。采用FACScom软件及CD3-APC、CD8-PercP 、IFN-γ-FITC、IL-4 – PE抗体单双标记的淋巴细胞调节仪器的补偿，采用Cellquest软件获取分析细胞。以前向角（FSC）和侧向角（SSC）散射光散点图设门区分淋巴细胞，以CD3和CD8散点图设门区分Th细胞（CD3+CD8-）。最终以IFN-γ和IL-4的散点图表示Th1细胞和Th2细胞。
5）流式细胞术检测小鼠外周血Th1和Th2细胞。分离外周血单个核细胞，加入100ng/ml PMA和1µg/ml 离子霉素刺激5h后，收集细胞。将细胞分为两份，称为对照管和实验管，加入CD4－CYC 10µl，混匀，其余步骤同人的检测。调节仪器的补偿，采用Cellquest软件获取分析细胞。以前向角（FSC）和侧向角（SSC）散射光散点图设门区分淋巴细胞，以CD4直方图设门区分Th细胞（CD4+），以IFN-γ和IL-4的散点图表示Th1细胞和Th2细胞。
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