外周血细胞的分离

• 简介

淋巴细胞是免疫系统中最重要的细胞，在免疫中起关键作用，维持内环境的稳定。对人的外周血淋巴细胞进行染色体核型分析对人类遗传研究及临床应用有重大意义。外周血液中的小淋巴细胞，几乎都处在G1期(或Go期)，一般情况下是不再分裂的，在培养液中加入植物凝血素 (PAH) 时，这种小淋巴细胞受刺激转化成为淋巴母细胞，随后进入有丝分裂。这样经过短期培养，秋水仙素的处理，低渗和固定，就可获得大量的有丝分裂细胞。本方法已为临床医学、病毒学，药理学、遗传毒理学等方面广泛应用。

• 实验原理

采用密度梯度离心法提取人外周血淋巴细胞用于培养

• 实验步骤：

1、将采到的肝素抗凝血取样计数白细胞总数。
2、使用Hank’s液/PBS液/无血清RPMI1640将血样1:1稀释，吹匀后于37℃水浴中平衡。
3、从冰箱中取出4℃避光保存的淋巴细胞分离液。摇匀后在无菌状态下加入刻度离心管中。
4、将盛有分离液的离心管放入37℃水浴中平衡。
5、用吸管将稀释的血液沿离心管壁缓缓铺于淋巴细胞分离液表面，拧紧管盖。
6、将离心管放置于水平离心机中，室温下 2000rpm离心20min。
7、离心结束后可见管内分为四层，从上至下分别为：血浆层（含部分血小板）、白膜层（含单个核细胞及少量血小板）、分离液层、粒细胞及红细胞层。将吸管轻轻穿过血浆层至白膜层，沿离心管周缘吸出血浆层与分离液层界面间的白膜层细胞，置于新离心管中。尽量少吸取分离液。
8.加吸出体积5倍以上的Hank’s/PBS/无血清RPMI1640液体，用吸管吹打均匀，避免产生气泡，液拄高度不要超过离心管的2/3。室温1500rpm离心10min，快速倾倒出上清液。
9.用Hank’s/PBS/无血清RPMI1640重悬细胞，注意吹打均匀，不要有细胞团块。室温下1500rpm离心5min，洗涤两次。最后一次洗涤时定量加入RPMI1640，吹打均匀后取样计数细胞。
10.最后一次离心完毕倾倒出上清液后请请要度离心管，将管底细胞摇匀。根据上一步的计数结果，用含FBS：10%-20%、双抗的RPMI1640培养液将细胞配成所需浓度。

• 注意事项：

1、步骤2中混匀时要沿管壁吹出，避免产生气泡。
2、步骤3操作中尽量避免吸管碰触管壁。原则上分离液的高度不超过管高的1/4。
3、步骤5血液铺于分离液表面时要注意用力要轻，避免血液冲入分离液中，使得稀释血重叠在分离液面以上。并且稀释血与分离液的高度比在1:2-2:1之间。原则上两者的总高度不超过离心管的2/3。
4、步骤6离心过程中要观察离心速度是否正确，且在停止时选择“no break”，避免因为急剧减速将已经分离的单个核细胞层重新弄混。注意离心结束时的减速过程，不要太快。
5、分离淋巴细胞的离心管以小管径为佳，细胞层相对厚，便于淋巴细胞的吸取。
6、2000rpm的相对离心力大概在573g-708g，不同的离心机可以注意计算一下离心力与转数的关系。
7、离心速度太慢或时间不足时，淋巴细胞层较薄，且在这个层面上有红细胞混杂；离心速度太快或时间过长时，淋巴细胞层相对分散，会进入下面的分离液层。
8、每次将离心管带入超净台内时要用酒精擦拭离心管，尤其管口和管帽。