PBS-T II 平末端快速连接试剂盒（含加A液 载体 连接

【原创】入门级T载体构建过程

了一下，小提了质粒，做了酶切。（Kpn I和EcoR I是我的引物上带的位点） 酶切鉴定完了之后，从6号和7号克隆菌液中各取了1 ml送测序。结果6号有两个位点突变，还少了一小段，7号正确，算是运气比较好吧。接下来的操作，论坛上已经有很多大佬说过了，到了这一步之后，可能后面遇到的主要问题就是连接。Takara的T4连接酶说明书上说，载体与目的片段分别是0.03 pmol和0.3 pmol，也就是1:10。我一般就是按照说明书做的，效果也还行。但是，我做的片段都比较短，可能大片段的话要调整比例

连接酶介绍

DNA连接酶是1967年在三个实验室同时发现的。它是一种封闭DNA链上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA链的5'-PO4与另一DNA链的3'-OH生成磷酸二酯键。但这两条链必须是与同一条互补链配对结合的(T4DNA连接酶除外)，而且必须是两条紧邻DNA链才能被DNA连接酶催化成磷酸二酯键。常用的DNA连接酶有两种：来自大肠杆菌的DNA连接酶和来自噬菌体的T4DNA连接酶。二者的作用机理类似。T4连接酶作用分三步：(1) T4DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶－AMP复合

连接酶简介

的线状DNA。 T4DNA连接酶连接要求和结果 外源DNA末端性质 连接要求 连接结果 不对称粘性末端 两种限制酶消化后，需纯化载体以提高连接效率 载体与外源DNA连接处的限制酶切位点常可保留；非重组克隆的背景较低；外源DNA可以定向插入到载体中。 对称性粘性末端 线形载体DNA常需磷酸酶脱磷处理 载体与外源DNA连接处的限制酶切位点常可保留；重组质粒会带有外源DNA的串联拷贝；外源DNA会以两个方向插入到载体中。 平端 要求高浓度的DNA和连接酶 载体与外源DNA连接处的限制