细胞样品细胞色素C氧化酶活性测定试剂盒

细胞样品细胞色素C氧化酶活性测定试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

细胞样品细胞色素C氧化酶活性测定试剂是一种旨在通过细胞色素C氧化酶反应系统中还原性细胞色素C氧化后吸光峰值的降低，即采用比色法测定样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术由大师级科学家精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞（动物、人体、植物、昆虫等）裂解悬液中或人体体液（例如血清等）细胞色素C氧化酶的活性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。

技术背景

细胞色素C氧化酶（Cytochrome c oxidase）存在于真核生物的细胞线粒体上，主要通过氧化磷酸化为细胞提供能量。基于底物还原型细胞色素C（reduced cytochrome c），受到细胞色素C氧化酶的催化，转化为氧化型细胞色素C（oxidized cytochrome c），在分光光度仪下，出现吸光值的变化（550nm 波长），由此定量测定细胞色素C氧化酶的活性。细胞色素C氧化酶反应系统为：



产品内容

清理液（Reagent A） 毫升
裂解液（Reagent B） 毫升
缓冲液（Reagent C） 毫升
反应液（Reagent D） 毫升
稀释液（Reagent E） 毫升
稳定液（Reagent F） 微升
产品说明书 1份

保存方式

保存清理液（Reagent A）、缓冲液（Reagent C）和稀释液（Reagent E）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里；反应液（Reagent D）避免光照；有效保证6月

用户自备

1.5毫升离心管：用于反应液和样品制备的容器
15毫升锥形离心管：用于样品制备的容器
细胞刮脱棒：用于细胞脱离
（微型）台式离心机：用于样品操作
比色皿：用于比色的容器
分光光度仪：用于比色分析

实验步骤

• 样品准备

1. 1. 准备好25cm²细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 10⁶细胞）
   2. 小心加入xx毫升清理液（Reagent A），覆盖生长表面
   3. 小心抽去清理液
   4. 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：可以使用胰酶消化）
   5. 加入xx毫升清理液（Reagent A），混匀细胞
   6. 移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）
   7. 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g
   8. 小心抽去上清液
   9. 加入预冷的xx微升裂解液（Reagent B），充分混匀
   10. 转移到预冷的1.5毫升离心管
   11. 强力涡旋震荡15秒
   12. 置于冰槽里孵育30分钟
   13. 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
   14. 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
   15. 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－YD30030.1）
   16. 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

• 测读准备

1. 准备好待测样品，置于冰槽里融化
2. 设定好分光光度仪：温度25℃，波长550nm，间隔10秒，测读7次（共60秒），并置零或设置0秒和60秒各测读1次
3. 测定开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的反应液（Reagent D）置入冰槽里融化，然后移出100微升到新的1.5毫升离心管，加入xx微升稳定液（Reagent F），轻柔混匀后，室温下避光静置至少15分钟（可见颜色变化），置于冰槽里，标记为反应工作液（注意：参见注意事项4），放在暗室里备用。然后进行下列操作。

• 背景对照测定

1. 移取xx微升缓冲液（Reagent C）到新的1毫升比色皿
2. 加入xx微升稀释液（Reagent E）
3. 上下倾倒数次，混匀
4. 室温下孵育2分钟
5. 放进分光光度仪，置零
6. 取出比色皿
7. 加入xx微升含有反应液（Reagent D）和稳定液（Reagent F）的反应工作液
8. 上下倾倒数次，混匀
9. 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照（0秒读数－60秒读数），

• 样品测定

• 1. 移取xx微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
  2. 加入100微升待测样品（注意：建议总量50微克总蛋白，且样品需澄清）
  3. 上下倾倒数次，混匀
  4. 室温下孵育2分钟
  5. 放进分光光度仪，置零
  6. 取出比色皿
  7. 加入xx微升含有反应液（Reagent D）和稳定液（Reagent F）的反应工作液
  8. 即刻上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
  9. 即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数（0秒读数－60秒读数），
• 计算样品活性

注意事项

1. 本产品为20次操作，包括背景对照
2. 操作时，须戴手套
3. 样品制备中忌用DTT和巯基乙醇等处理
4. 每增加1个样品，增加反应工作液为：反应液（Reagent D）50微升＋稳定液（Reagent F）1.5微升，以此类推。配制反应工作液时，须根据样本数量配制实际工作液容量。
5. 系统操作过程中，背景测定只需1次
6. 分光光度计波长严格设置在550nm，误差10nm将不产生信号
7. 加样后3秒内进行比色测定
8. 比色测定后，比色皿须清洗彻底
9. 背景空对照0秒读数通常0.2至0.8为理想状态
10. 背景空对照的正常读数差值（0秒－60秒）通常为0.001至0.005（正负即可）
11. 样品0秒读数通常和背景空对照0秒读数一致
12. 样本测定60秒读数低于0秒读数表明具有酶活性
13. 酶活性单位浓度定义：在25℃室温下，pH 7.0的情况下，每单位酶在单位时间内（每分钟）氧化1微摩尔的细胞色素C
14. 建议待测样本总蛋白浓度为50微克/100微升；如果样本酶活性过低或过高，则可以增加或降低样本量（本公司提供 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒YD30030.1）
15. 本公司提供系列细胞色素相关试剂产品

质量标准

1. 本产品经鉴定性能稳定
2. 本产品经鉴定检测敏感

使用承诺

上海羽哚生物秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后10天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。

友情提醒

IF IT DOESN’T WORK， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。