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        细胞色素氧化酶二氨基联苯胺显示法(DAB法)

        互联网

        13074

        细胞色素氧化酶二氨基联苯胺显示法( DAB 法)

        氧化酶(oxdase)和脱氢酶(dehydrogenase)均使底物脱氢“氧化”,所不同的是氧化酶将氢与氧结合,而脱氢酶则把氢传给其他物质即受氢体,如辅酶I(NAD),辅酶Ⅱ(NADP)或黄素蛋白。

        细胞色素氧化酶(cytochrome oxidase,CCO)在细胞有氧呼吸中起重要作用,为线粒体膜固有酶,是线粒体标志酶之一,常作为细胞内氧化代谢指标。在含有大量线粒体的细胞内均有高强度细胞色素氧化酶活性。

        3,3, ―二氨基联苯胺(3,3, ―diaminobenzidine,DAB)在细胞色素氧化酶的催化下,其侧链氨基被氧化,并进行反复氧化性聚合和氧化性环化,形成不溶性褐色吩嗪(phenazine)聚合体,DAB将氧化型细胞色素C还原,还原型细胞色素C又被细胞色素a再氧化。通过该循环的反复进行,DAB不断被氧化,反应氧化物沉积。DAB氧化物含有活性游离基,该游离基能使四氧化锇还原形成锇黑,故可在电镜下观察。

        (1)孵育液配制
        蒸馏水 5ml
        3,3, ―二氨基联苯胺-4-盐酸盐 5mg
        0.2mol/L磷酸缓冲液(pH 7.4) 5ml
        过氧化氢酶C―100 lmg
        细胞色素CⅢ型 10mg

        (2)操作程序
        ①新鲜或固定组织冰冻切片,厚5~10um;

        ②孵育液中37℃孵育40~60分钟,充分洗涤;

        ③复染:亚甲蓝染核;

        ④甘油明胶封片。

        (3)结果
        酶活性部位呈棕褐色沉淀,细胞内线粒体数目多者酶活性强。
        细肭色素氧化酶DBA法

        大鼠骨骼肌纤维横断和纵断面中呈棕色为细胞色素氧化酶阳性反应

        (4)对照实验
        孵育液内加1mmol/L KCN或l0mmol/L NaN3 ,反应完全呈阴性。抑制剂为氰化物、叠氮化钠(NaN3 )、硫化氢(H2 S)和一氧化碳,原因是这些物质均能与细胞 色素氧化酶的三价铁结合而抑制酶活性。从反应液中去掉底物DAB不能成为对照,因为DAB同时也是成色剂。

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