活体细胞线粒体内膜功能/膜电位红色荧光（TMRM）测定试剂盒

活体细胞线粒体内膜功能/膜电位红色荧光（TMRM）测定试剂盒产品说明书
（中文版）

主要用途

活体细胞线粒体内膜功能/膜电位红色荧光（TMRM）测定试剂是一种旨在通过四甲基罗丹明甲酯染料，选择性地聚集在线粒体内呈现荧光染色，其荧光的增强或减弱说明线粒体膜电位的变化，即内膜电负性的增高或降低，来分析线粒体内膜功能的完整性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种线粒体制备物的功能检测。可以被用于细胞凋亡、信号传递、衰老等的研究。产品严格无菌，即到即用，活体检测，操作简易，性能稳定。

技术背景

四甲基罗丹明甲酯（tetramethylrhodamine methyl ester；TMRM），为罗丹明衍生物阳离子染料，作为电势测定（potentiometric）荧光探针：第一，具有亲脂性的，且细胞低毒和光稳定； 第二，与线粒体内膜负电极结合而聚集；第三，容易进入细胞及其线粒体。四甲基罗丹明甲酯进入细胞后，被细胞内酯酶切离，产生四甲基罗丹明。四甲基罗丹明进入线粒体后，被线粒体俘获，分布和结合在线粒体内膜上，呈现强烈荧光。线粒体膜电位的高低变化决定了TMRM的分布浓度。电位高，TMRM在线粒体的浓度高，显示为强力红色或桔红色；反之，TMRM弥散在胞浆内，荧光减弱表明线粒体膜电位受到损害。

产品内容

染色液（Reagent A） 微升
稀释液（Reagent B） 毫升
清理液（Reagent C） 毫升
产品说明书 1份

保存方式

保存 清理液（Reagent C）在4℃冰箱里，其余的保存在－20℃冰箱里； 染色液（Reagent A）避免光照；有效保证6月

用户自备

胰蛋白酶乙二an四乙酸混合液（ YD12024）：用于细胞脱离
完全细胞培养液（ YD12052）：用于细胞脱落收集
1.5毫升离心管：用于活体细胞线粒体染色的容器
微型台式离心机：用于细胞收集的操作
培养箱：用于染色孵育
（共聚焦）荧光显微镜：用于活体细胞线粒体荧光定性分析
比色皿或96孔板：用于荧光定量分析的容器
荧光分光光度仪或荧光酶标仪：用于活体细胞线粒体荧光定量分析
细胞流式仪：用于活体细胞线粒体荧光分析

实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的 染色液（Reagent A）置入冰槽里融化， 稀释液（Reagent B）放进37℃恒温水槽里预热。然后移出xx微升 染色液（Reagent A）到新的1.5毫升离心管，加入xx微升 稀释液（Reagent B），混匀后，在冰槽里静置，并标记为 染色工作液，放在暗室里。然后进行下列操作。

一、直接法

1. 准备1个24孔细胞培养板的待测细胞，每孔铺满率达70％（约10⁵细胞数）
2. 小心抽去细胞培养液
3. 轻轻沿着孔壁加入xx毫升 清理液（Reagent C）到细胞培养孔，覆盖培养孔表面
4. 小心抽去xx毫升 清理液（Reagent C）
5. 加入xx微升含有 染色液（Reagent A） 和 稀释液（Reagent B）的 染色工作液，覆盖培养孔表面
6. 放进37℃细胞培养箱里，孵育20分钟（注意避光）
7. 小心抽去xx微升 染色工作液
8. 小心加入xx微升 清理液（Reagent C）（注意：检测前置于冰槽里）
9. 即刻在倒置荧光显微镜下进行观察（滤波器激发波长540nm，散发波长580nm ）――可见

亮橘红色荧光；如果强度显著减弱，表明线粒体膜电位受到破坏

二、间接法

1. 准备1个12孔细胞培养板的待测细胞，每孔铺满率达70％（约30万细胞数）
2. 小心移出细胞培养液到15毫升锥形离心管（收集悬浮细胞）
3. 加入xx毫升 清理液（Reagent C）到细胞培养孔，覆盖培养孔表面
4. 小心移出xx毫升 清理液（Reagent C）到15毫升锥形离心管（收集洗脱细胞）
5. 加入500微升用户自备的胰蛋白酶乙二an四乙酸混合液，铺满整个培养孔表面
6. 置入37℃培养箱1分种
7. 轻轻抖动培养板，使细胞脱落，然后加入1毫升完全细胞培养液
8. 移入15毫升锥形离心管
9. 放进 台式离心机离心5分钟，速度为300g
10. 小心抽去上清液
11. 加入xx微升 清理液（Reagent C）
12. 用200微升枪头上下轻柔抽吸，混匀细胞颗粒群
13. 转入到1.5毫升离心管或细胞流式仪专用测试管
14. 加入xx微升含有 染色液（Reagent A） 和 稀释液（Reagent B）的 染色工作液
15. 轻度涡旋震荡2秒
16. 放进37℃细胞培养箱里，孵育20分钟（注意避光）
17. 放进 台式微型离心机离心5分钟，速度为300g
18. 小心抽去上清液
19. 加入xx微升 清理液（Reagent C）（注意：检测前置于冰槽里）

选择一、（共聚焦）荧光显微镜观察

1. 1. 混匀后，移出50微升在载玻片上
   2. 即刻进行载玻片压片，在荧光显微镜下进行观察（滤波器激发波长540nm，散发波长580nm） ――可见亮橘红色荧光；如果强度显著减弱，表明线粒体膜电位受到破坏

选择二、细胞流式仪分析

1. 混匀后，即刻进行细胞流式仪分析：观察50000个细胞以上

激发波长	488nm
匹配荧光染料	藻红蛋白（phycoerythrin；PE）
荧光颜色	红色
散发波长	575
流式仪通道	FL2
荧光增强	膜电位正常

选择三、荧光分光光度仪或荧光酶标仪测定

1. 混匀后，移出100微升到黑色96孔板里或100微升比色皿里
2. 即刻进行荧光分光光度仪或荧光酶标仪测定（激发波长540nm，散发波长580nm），获得相对荧光单位（RFU）：RFU值高表明线粒体膜电位正常

注意事项

1. 本产品为20次（0.5毫升工作液）操作
2. 操作时，须戴手套
3. 待测细胞建议不要过于饥饿或过度生长
4. 建议细胞染色完成后，即刻进行荧光检测分析
5. 孵育时，避免光照
6. 健康细胞和线粒体呈现橘红色；死亡或凋亡细胞及损伤线粒体呈现黯淡或无荧光
7. 本公司提供FCCP溶液，作为线粒体膜电位破坏分子，观察荧光显著减弱现象
8. 本公司提供系列线粒体试剂产品

质量标准

1. 本产品经鉴定性能稳定
2. 本产品经鉴定荧光清晰

使用承诺

上海羽哚生物秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后10天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。

友情提醒

IF IT DOESN’T WORK， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。