Hieff Mut™ Multi Site-Directed Mutagenesis Kit多点突变试剂盒产品描述
Hieff MutTM Multi Site-Directed Mutagenesis Kit是基于Hieff CloneTM快速克隆技术的定点突变系统。使用本试剂盒,可一次性向目标质粒上三至五个不连续位点(相距超过50bp)同时引入定点突变。该试剂盒由两个模块组成:HieffTM II Pfu DNA Polymerase扩增模块和Hieff CloneTM快速克隆模块。HieffTM II Pfu DNA Polymerase超高的保真度显著降低了扩增过程中引入新突变的可能性,其卓越的长片段扩增能力,广泛适用于长度小于20 kb的任何质粒扩增。Hieff CloneTM快速克隆系统利用高效的同源重组反应替代传统的退火成环反应。因此使用Hieff MutTM Multi Site-Directed Mutagenesis Kit进行DNA定点突变时,引物设计更加灵活,且扩增反应以指数方式进行,极大减少了模板使用量,有利于原始甲基化模板的彻底降解。
Hieff MutTM Multi Site-Directed Mutagenesis Kit中的重组酶Exnase MultiS经过优化,专门针对多碱基进行定点突变。此外,如扩增产物特异,其DpnI消化产物可不进行DNA纯化而直接用于重组反应。高度优化的反应缓冲液、快捷的操作流程以及极高的成功率,使得Hieff MutTM Multi Site-Directed Mutagenesis Kit成为DNA多点突变首选试剂盒。
Hieff Mut™ Multi Site-Directed Mutagenesis Kit多点突变试剂盒应用范围
以待突变位点A、B、C为界,将质粒分为AB、BC段和CA段。使用HieffTM II Pfu DNA Polymerase对各段分别进行扩增。AB段扩增引物对为:待突变位点A正向扩增引物和待突变位点B反向扩增引物;BC段扩增引物对为:待突变位点B正向扩增引物和待突变位点C反向扩增引物;CA段扩增引物对为:待突变位点C正向扩增引物和待突变位点A反向扩增引物。
2.1 配制PCR反应体系
反应各组分解冻后请充分摇匀,使用完毕后及时放回-20℃。2×HieffTM II PCR buffer请勿长时间敞口放置。
为了增加扩增特异性,反应体系配制过程请于冰水浴中进行。为了防止HieffTM II Pfu DNA Polymerase的校对活性降解引物,请将聚合酶最后加入反应体系中。
推荐反应体系如下:
ddH2O
Up to 50 μl
2×HieffTM II PCR buffer
25 μl
dNTP Mix (10 mM each) a
1 μl
模板DNA b
Optional
引物1 (10 μM)
2 μl
引物2 (10 μM)
2 μl
HieffTM II Pfu DNA Polymerase (1 U/μl) c
1 μl
a. 请勿使用dUTP和带有尿嘧啶的引物或模板。
b 在各片段能正常扩增的前提下,应尽量减少质粒模板使用量,推荐≤1 ng。待扩增质粒长期放置、反复冻融会导致模板质粒断裂、开环或降解,因此推荐使用新鲜制备的质粒作为模板。
c. 推荐的酶的终浓度为1 U/50 μl反应。可将HieffTM II Pfu DNA Polymerase在0.5-2 U/50 μl之间进行优化,但不要超过2 U/50 μl,尤其当扩增子长度大于5 kb时。
2.2 PCR扩增反应
推荐PCR反应条件:
循环步骤
温度
时间
循环数
预变性
95℃
30 sec
1
变性a
退火b
延伸c
95℃
60℃~72℃
72℃
15 sec
15 sec
30-60 sec/kb
30 d
彻底延伸
72℃
5 min
1
a. 对于大多数质粒,变性温度使用95℃即可。
b. HieffTM II Pfu DNA Polymerase能够促进模板和引物高效退火。一般来说,退火温度设置为引物Tm值即可。如果需要,可以建立一个温度梯度反应去寻找引物模板结合的最适温度。退火时间太长可能导致扩增产物在胶上呈现弥散状。
c. 对于大多数扩增反应,延伸过程可在72℃进行。长的延伸时间有助于提高扩增产量。
d. 为了防止扩增过程中引入非目标突变,强烈建议扩增循环数≤35。如果扩增效率良好的话,推荐扩增循环数应≤30。
质粒AB、BC和CA段扩增产物末端分别包含相对应的完全一致的一段序列,因此在Exnase MultiS催化下三扩增产物末端可以发生同源重组,完成扩增产物环化过程。于冰水浴中,将下列组分依次加到无菌的1.5 ml Eppendorf管或PCR管的管底。如果不慎将液体粘在管壁,请务必通过短暂离心使其沉入管底。体系配制完成后,用移液器上下轻轻吹打几次混匀各组分,避免产生气泡 (请勿剧烈震荡或者涡旋混匀)。