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GSTSep Glutathione Agarose Resin 4FF
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翌圣生物科技(上海)股份有限公司
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10ml/50mL/100 mL
规格: | 10ml | 产品价格: | ¥1178.0 |
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规格: | 50mL | 产品价格: | ¥4338.0 |
规格: | 100 mL | 产品价格: | ¥7538.0 |
货号 | 20508ES10/20508ES50/20508ES60/20508ES80 |
规格 | 10 mL /50 mL /100 mL/1000 mL |
基质(Matrix) | 高度交联的4%琼脂糖微球 |
配体(Ligand) | 通过12原子间隔臂偶联的谷胱甘肽 |
粒径(Bead size) | 45-165 µm |
载量(Capacity) | >10 mg GST蛋白(40 kDa)/mL基质 |
最大压力(PressureMax) | 0.3 MPa,3 bar |
pH稳定范围(pH range) | 3-12 |
储存缓冲液(Buffer) | 含20%乙醇的1×PBS |
问题 | 可能原因 | 推荐解决方案 |
柱子反压过高 |
填料被堵塞 |
清洗树脂 |
裂解液中含有微小的固体颗粒,建议上样前最好用0.22 µm或0.45 µm滤膜过滤,或离心去除 | ||
样品太黏稠 | 样品中含高浓度的核酸,延长破碎时间直至粘度降低,或添加DNaseI (终浓度为5 µg/mL),Mg2+(终浓度1 mM),冰上孵育10-15 min | |
缓冲液太黏稠 | 有机试剂或蛋白稳定试剂(如甘油等)可能会引起反压增高,降低操作流速 | |
洗脱组分中无目的蛋白 |
GST标签蛋白变性了 | 使用温和的裂解条件,实验条件以经验为准 |
过度的裂解使目的蛋白变性 | ||
目的蛋白聚集产生沉淀 | 在细胞裂解前溶液中加入DTT,终浓度为1-10 mM | |
融合蛋白改变了GST的构象,影响了目的蛋白的结合力 | 测定pGEX中GST的结合力,对载体进行超声处理,检测其结合力。如果载体中GST有很高的亲和力,有可能是改变融合蛋白的构象从而降低了GST标签蛋白的亲和力 | |
降低结合温度至4℃,充分清洗 | ||
柱子平衡时间太短,目的蛋白不是在pH 6.5-pH 8.0范围内结合 | 用pH 6.5-pH 8.0的buffer进行充分的平衡,如PBS | |
目的蛋白没有完全洗脱下来 |
洗脱体积太少 | 增加洗脱液体积,减小洗脱流速。 |
洗脱液中谷胱甘肽浓度太低 | 增加洗脱液中还原型谷胱甘肽浓度,可尝试用20-40 mM还原型谷胱甘肽洗脱 | |
低pH影响洗脱 | 在不增加洗脱液中谷胱甘肽量时,提高洗脱液中pH至pH 8-9会有改善 | |
增加洗脱液中离子强度,如0.1-0.2 M NaCl | ||
洗脱液中谷胱甘肽被氧化 | 使用新鲜配制的洗脱液 | |
加入DTT | ||
非特异性疏水作用影响目的蛋白的溶解和洗脱 | 洗脱液中加入非离子型洗涤剂,如0.1%的Triton X-100或者2%正辛基-β-D-吡喃葡糖苷Tween-20 | |
电泳或Western Blot检测中发现多条带 |
Mr 70000蛋白与目的蛋白一起纯化下来 | Mr 70000蛋白可能是大肠杆菌基因DnaK的产物,可以在目的蛋白中加入50 mM Tris-HCl,2 mM ATP,10 mM MgSO4,pH 7.4在37℃加热10min去除 |
可通过ATP-琼脂糖胶或离子交换来去除目的蛋白溶液中的dnaK蛋白 | ||
GST融合蛋白已经发生降解 | 在裂解液中加入蛋白酶抑制剂,如加入1 mM PMSF | |
可能是蛋白酶对目的蛋白部分降解造成的,可使用蛋白酶缺陷型宿主菌(如lon-或ompT) | ||
细胞破碎过度 | 减少细胞破碎时间,超声前加入溶菌酶(菌液体积的0.1倍10 mg/mL溶菌酶,25 mM Tris-HCl,pH 8.0),避免发泡导致蛋白酶变性,过度超声破碎增加宿主内源蛋白与GST融合目的蛋白的共纯化。 | |
共价共纯化 | 包括促进蛋白正确折叠的分子伴侣的共纯化,如:DnaK(Mr~70000),DnaJ(Mr~37000),GrpE(Mr~40000),GroEL(Mr~57000),GroES(Mr~10000) | |
抗体与E. coli的各种蛋 白反应 |
抗体吸附E. coli蛋白:GST-抗体;超声处理去除GST抗体,可以用Western Blot检测 |
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