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McrBC

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    识别位点




    ■ 检测 CpG 二核苷酸的甲基化状态
    ■ 检测胞嘧啶甲基化了的 DNA


    来源
    从 E. coli K-12 菌株分别纯化 McrB 和 McrC 蛋白，该E. coli K-12 菌株包含有 McrB 和 McrC 的编码质粒（1）。


    反应条件
    NEBuffer 2 + BSA + GTP
    [50 mM NaCl，10 mM Tris-HCl，10 mM MgCl2，1 mM DTT(pH7.9 @ 25 ℃)]，加入 100 μg/ml BSA 和 1 mM GTP（随酶提供）。37 ℃ 温育。


    随酶提供的试剂
    10X NEBuffer 2
    100X BSA
    100X GTP（100 mM）
    质粒 DNA 对照


    质保声明
    无核酸内、外切酶的污染。


    单位定义
    1 单位指在 50 μl 反应体系中，在 37 ℃ 条件下 1 小时完全切割 1 μg 含有多个该酶识别位点的质粒所需要的酶量。
    当切割基因组的 DNA 时，需要对所加酶的量进行摸索，建议使用 5-10 倍的酶量。


    浓度
    10,000 units/ml。


    贮存缓冲液
    300 mM NaCl，10 mM Tris-HCl（pH 7.4），0.1 mM EDTA，1 mM DTT，500 μg/ml BSA 和 50% 甘油。贮存于-20 ℃。


    稀释兼容性
    稀释液B。


    热失活
    65°C 20分钟。


    注意
    该酶在每一对半位点之间切割一次，切割位点靠近这一对识别半位点的一侧，但通常距最近的甲基化碱基一侧大约30 bp(2)。当DNA片段含有多个McrBC识别半位点时(如含有甲基化胞嘧啶的基因组DNA)，因该酶的上述切割位点不确定特性，从而产生模糊不清晰的电泳条带。


    参考文献
    (1) Sutherland, E. et al. (1992) J. Mol. Biol ., 225, 327–334.
    (2) Stewart, F.J. and Raleigh E.A. (1998) Biol. Chem ., 379,611–616.
    (3) Panne, D. et al. (1999) J. Mol. Biol ., 290, 49–60.
    (4) Stewart, F.J. et al. (2000) J. Mol. Biol ., 298, 611–622.
    (5) Raleigh, E.A. (1992) Mol. Microbiol ., 6, 1079–1086.


    人类和果蝇基因组 DNA 与 McrBC 酶温育。脊椎动物 DNA 中有 60-90% 的 CpG 是甲基化的（6），而果蝇 DNA 中 CpG 的甲基化非常罕见（几乎12.5 Kb DNA 出现一个 5-甲基胞嘧啶）（7）。Lane1，人类 DNA；Lane 2，与 McrBC 酶温育后的人类DNA；Lane 3，果蝇 DNA；Lane 4，与 McrBC 酶温育后的果蝇 DNA；Lane 5，Marker:经 BstEII 消化后的Lambda DNA。


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