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蛋白磷酸酶 1 (PP1)

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    ♦ 蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶活性
    ♦ 一些酪氨酸磷酸酶活性


    概述
    蛋白磷酸酶1 (PP1)是一种Mn2+ 依赖型蛋白磷酸酶,对磷酸化的丝氨酸/苏氨酸残基有活性。由330个氨基酸组成,编码于兔骨骼肌中1型蛋白磷酸酶α-亚型催化亚基(1,2)。重组的PP1对磷酸化酪氨酸残基也有部分活性(3,4)。

    研究发现,细菌中表达的1型蛋白磷酸酶的α和γ异构体,其催化亚基能使蛋白中的磷酸化酪氨酸残基去磷酸化(3,4)。PP1对磷酸化组氨酸残基也有活性(5)。


    来源
    重组 E. coli 菌株,携带有编码兔骨骼肌PP1基因序列,受 trp-lac 混合启动子(Dr.E.Y.C.Lee惠赠)调控(1,2)。


    反应条件
    1X 蛋白金属磷酸酶(PMP)反应缓冲液 [50 mMHEPES(pH 7.5 @ 25 ℃),100 mM NaCl, 2 mM DTT和 0.01% Brij 35]。加入 1 mM MnCl2 ,30 ℃ 温育。


    随酶提供的试剂
    10X 蛋白金属磷酸酶(PMP) 反应缓冲液
    10X MnCl2 (10 mM)


    比活性
    ~25,000 units/mg。


    分子量
    37.5 kDa。


    品质保证
    无蛋白酶活性污染。


    单位定义
    1 单位指在 50 μl 的反应体系中,30 ℃条件下1 分钟内水解 1 nmol 的对硝基苯酚磷酸盐(50 mM,NEB #P0757)所需的酶量。


    浓度
    2,500 units /ml。


    贮存条件
    200 mM NaCl, 50 mM HEPES(pH 7.0 @ 25 ℃),1 mM MnCl2 ,0 1 mM EGTA,2.5 mM DTT,0.025% Tween 20和 50% 甘油。贮存于 -70 ℃,避免反复冻融。


    热失活
    65°C 1小时。


    使用注意
    建议用 PP1 对蛋白进行去磷酸化的初始反应条件为:
    在 50 μl 反应体系中,0.1 units 的 PP1 在 30 分钟内可以除去磷酸化酶的磷酸化丝氨酸/苏氨酸残基的,或者 10 μM(就磷酸浓度而言)的髓磷脂碱蛋白(phospho-MyBP,18.5 KDa)中的,约 100% 的磷酸基团(0.5 nmol)。
    用磷酸化酶激酶对磷酸化酶上的丝氨酸残基进行磷酸化,用磷酸化的磷酸化酶作为底物,来估算PP1 的蛋白丝氨酸/苏氨酸磷酸酶(PSP)活性。也可用 cAMP 依赖型蛋白激酶磷酸化 MyBP 的丝氨酸/苏氨酸残基,并用磷酸化的 MyBP 作为底物估算酶活。


    参考文献
    (1) Bai, G. et al. (1988) FASEB Journal , 2, 3010–3016.
    (2) Zhang, Z. et al. (1992) J. Biol. Chem ., 267, 1484–1490.
    (3) Barshevsky, T. and Roberts, R.J. (1997) The NEB Transcript 8, 14. 
    (4) MacKintosh, C. et al. (1996) FEBS Letters , 397, 225–238.
    (5) Kim, Y. et al. (1993) J. Biol. Chem ., 268, 18513–18518.


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