PCAMBIA3301 植物双元表达载体

植物基因工程表达载体的改进和优化策略

将特定的外源基因构建在植物表达载体中并转入受体植物，并不是植物遗传转化的最终目的。理想的转基因植物往往需要外源基因在特定部位和特定时间内高水平表达，产生人们期望的表型性状。然而，近二十年的发展历史却表明，外源基因在受体植物内往往会出现表达效率低、表达产物不稳定甚至基因失活或沉默等不良现象，导致转基因植物无法投入实际应用。另外，转基因植物的安全性问题已在许多国家引起人们的关注，例如，转基因有可能随花粉扩散，抗生素筛选标记基因有可能使临床上的某些抗生素失去作用等等。以上问题的出现使得植物

植物基因转化常用方法

的，也可以是多拷贝的，成串联形式排列，但整合位点的特异性尚未确定。 （二）Ti质粒转化植物细胞的战略 1. Ti质粒的改造 有以下理由使天然的Ti质粒不能作为表达载体使用： a. 生长在培养基上的植物转化细胞产生大量的生长素和分裂素阻止了细胞再生长为整株植物，因此，必须除去生长素和分裂素基因。 b. 有机碱的合成与T-DNA 的转化无关，而且可能会影响植物细胞生长，因为有机碱合成大量消耗精氨酸和谷氨酸，因此必须去除有机碱合成基因（tmt） c. Ti质粒约为200kb，重组操作非常苦难

Termal Asymmetric Interlaced PCR（TAIL-PCR）

和非特异性产物(Ⅰ型和Ⅲ型)。第二次反应则将第一级反应的产物稀释1000倍作为模板，通过10次热不对称的超级循环，使特异性产物被选择地扩增，而非特异产物含量极低。第三次反应又将第二次反应的产物稀释作模板，再设置普通的PCR反应或热不对称超级循环，通过上述3次PCR反应可获得与已知序列邻近的目标序列。 Gento等曾用构建的含有潮霉素抗性基因(hph)的双元表达载体pBIG2RHPH2转化真菌，然后利用TAIL-PCR法克隆得到的真菌转化子基因组DNA的T-DNA插入区的旁侧序列并取得了成功。根据T