冷冻胎肝细胞未处理的胎肝cDNA，10次PCR反应

qPCR常见问题及其分析

， Fast程序，以cDNA为模板进行。C. 目的基因的设置：有几个目的基因和目的基因的名称。D. 样品的设置：包括哪个是实验组，哪个是对照组。以及负对照的设置和生物重复的设置。E. 对照组和内参基因的设置：这个是为后面的定量做准备F. 反应程序的设置：PCR反应程序的设置要根据不同公司的MasterMix。比如BioTeke的95℃ 2分钟就可以激活DNA聚合酶（ABI的需要10 分钟）。循环反应是95℃15秒，60℃15秒的40个循环。溶解曲线程序采用仪器默认设置就可以。或者是仪器说明书上建议的程序

Invitrogen RT-PCR 新工具

性，因而即使是最具挑战性的模板也可以进行有效的RT-PCR.。 通过SuperMix形式快速合成cDNA SuperScript™ III First—Strand Synthesis SuperMix将所有进行强大的、灵敏的第一链cDNA合成所必须的组分组合成快速、易于使用的 SuperMix形式。SuperMix形式包含 2x RT缓冲反应混合物、dNTPs、MgCl2、 以及由SuperScript™ III RT和RNaseOUT™.组成的酶混合物。也提供优化的退火缓冲

PCR和RT-PCR

PCR基础 聚合酶链式反应（PCR）过程利用模板变性，引物退火和引物延长的多个循环来扩增DNA序列。这是一个指数增长的过程，因为上一轮的扩增产物又作为下一轮扩增的模板，使其成为检测核酸的一种非常灵敏的技术。一般，经过20-30个循环得到的扩增产物就足够在溴化乙锭染色的凝胶上观察到。反应包括几个成分（表1）。模板可以为纯化的基因组或质粒DNA；由RNA转化得到的cDNA；或未经纯化的粗制生物样品，如细菌克隆或噬菌斑。引物确定了扩增产物的序列和长度。最常用的热稳定聚合酶是Taq DNA