4D-FastDIA磷酸化修饰组学

服务简介

       离子淌度分离（ion mobility）的引入，使得蛋白质（修饰）组学步入了4D新时代，带来蛋白质（修饰）组学在鉴定深度、检测周期、定量准确性等性能的全面提升，极大推动了蛋白质（修饰）组学技术发展与广泛应用。

       景杰生物基于对行业需求洞察及超万例的蛋白质（修饰）组学分析经验，在4D磷酸化修饰组的产品基础上，升级推出全新一代4D-FastDIA磷酸化修饰组定量技术服务。该技术服务延续了4D磷酸化修饰组无需肽段分级和高深度的特征，进一步结合4D-DIA策略，降低缺失值，提高定量的稳定性与平行性，尤其适用于大规模蛋白质组学定量分析。

 

技术原理

1、全新一代4D蛋白质组学

        4D蛋白质组学是在传统3D即保留时间（retention time）+质荷比（m/z）+离子强度（intensity）这三个维度基础之上增加了第四个维度--离子淌度的分离。同时结合timsTOF Pro大幅度提升的扫描速度和检测灵敏度，带来蛋白质组分析在鉴定深度、检测周期、定量准确性等性能的全面提升。

图1、新一代4D蛋白质组学

       4D蛋白质组学的特征之一是新增的双TIMS（Trapped Ion Mobility Spectrometry，捕获离子淌度），主要是根据分子的形状和截面进行分离，能够区分m/z一致的共洗脱多肽，从而产生唯一性的质谱二级谱图，许多在3D条件下中被掩盖的低丰度蛋白信号能够被快速高效区分和识别出来，极大提高检测灵敏度（图2）。

图2、TIMS带来更高专属性和灵敏度

       此外，timsTOF Pro质谱仪具备其独有的平行累积连续碎裂PASEF（Parallel Accumulation Serial Fragmentation）扫描模式。母离子选择与TIMS中离子的释放同步进行，扫描速度高达100Hz，可对低丰度的母离子进行智能叠加选择，可以实现近乎100％的离子利用率，并且带来扫描速度革命性的提升。在相同的定量条件和微量样品量下，4D技术可以鉴定到多50%-100%的蛋白质或修饰位点。

2、集大成者！4D-DIA技术路线

        DIA策略通过通过开大窗口采集整个区间的所有信号，实现数据的“无损采集”，来避免随机性所导致的不平行问题，在大队列、高通量分析中有更佳表现。但这直接导致的一个问题就是：谱图的混杂程度极高，一方面导致灵敏度有所降低，还会导致谱图的解析异常困难！2020年，全球蛋白质组领域科学家Matthias Mann教授团队与Ruedi Aebersold合作开发了基于4D平台的DIA技术——dia-PASEF^®。

       在dia-PASEF的扫描模式下，与离子淌度相关的CCS值和m/z之间有一定的相关性，因此四级杆可以利用这个特征逐步扫描来实现近乎100%的离子信号，极大提升检测的灵敏度和深度（图3）。除此之外，dia-PASEF中新增加的离子淌度维度，有效降低了谱图的复杂性，解决了DIA技术中面临的最大困境。基于离子淌度的二次分离和CCS数值的对齐，进一步提高了检测灵敏度同时增强了定量的可靠性。

图3、基于4D平台的dia-PASEF^®技术提升检测灵敏度与定量可靠性

 

a. dia-PASEF^®中的数据采集模式；b. dia-PASEF^®和DDA及传统DIA离子利用率的对比

仪器设备

Bruker timsTOF Pro/Pro2 

Exploris 480

 

技术优势

       4D-FastDIA磷酸化修饰组结合了4D磷酸化修饰组+dia-PASEF+深度神经网络搜库的众多权威技术，在磷酸化修饰组分析中表现不俗，进一步提升了组学定量的深度、重复性与稳定性。实测项目数据显示，样本间磷酸化位点overlap占比为80.0%，技术重复性高达Pearson 0.98。

图4、4D-FastDIA磷酸化修饰组学数据

应用领域

       4D-FastDIA磷酸化修饰组学延续了4D蛋白质组学平台在采集速度与灵敏度的大幅度提升，实现了蛋白和修饰位点的深度覆盖。采取4D-DIA数据采集策略，提升平行性与稳定性，展现了在大队列样本分析中的卓越稳定性。基于深度神经网络的搜库策略，实现高可靠度高解析度提取肽段信息。特别适用于大队列样本磷酸化修饰组分析。

 

参考文献

1、Florian Meier, et al. 2018. Online Parallel Accumulation-Serial Fragmentation (PASEF) with a Novel Trapped Ion Mobility Mass Spectrometer. Mol Cell Proteomics.

2、Ludwig C, et al. 2018. Data-independent acquisition-based SWATH-MS for quantitative proteomics: a tutorial. Mol Syst Biol.

3、Meier F, et al. 2020. diaPASEF: parallel accumulation-serial fragmentation combined with data-independent acquisition. Nat Methods.

4、Mehta D, et al. 2022. BoxCar and Library-Free Data-Independent Acquisition Substantially Improve the Depth, Range, and Completeness of Label-Free Quantitative Proteomics. Anal Chem.

5、Demichev V, et al. 2020. DIA-NN: neural networks and interference correction enable deep proteome coverage in high throughput. Nat Methods.