EndoFree Plasmid Maxi Kit 无内毒素

产品描述

 

      本试剂盒采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞，粗提物通过采用高效的去内毒素系统除去内毒素，然后离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后低盐、高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。

      每次可处理100-200 ml 细菌培养液，理论上最多可提取2mg质粒DNA

产品组分

 

试剂盒组成	保存	10次
RNaseA（10mg/mL）	4℃	1mL
Buffer I	4℃	120mL
Buffer II	室温	120mL
Buffer III	室温	120 mL
Buffer PI	室温	100mL
Buffer ER	室温	30mL
Buffer PB	室温	120mL
Buffer PW	室温	72mL 第一次使用前请加入168mL无水乙醇
Buffer PE	室温	50mL
Buffer TE	室温	30mL
针筒内毒素过滤器	室温	10个
吸附柱和离心管（50mL）	室温	10个

 

产品特点

 

1.离心吸附柱内硅基质膜全部采用高品质特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。

2.不需要使用有毒的ben酚，氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀。快速， 方便，从100-200 mL大肠杆菌LB((Luria-Bertani)培养液中，可快速提取0.5-2mg纯净的高拷贝质粒DNA，提取率达80-90 %。

3.本试剂盒提取的质粒DNA，内毒素含量极低（<0.1 EU/μg DNA），细胞转染效果ji佳。也可直接用于酶切、转化、PCR、体外转录、测序、等各种分子生物学实验。

运输和保存方法

1）本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。

2）第一次使用时，将试剂盒所带全部的RNase A加入Buffer I后（终浓度100ug/mL）置于4℃保存。如果Buffer I中RNase A失活，提取的质粒可能会混杂有微量RNA残留，在Buffer I中补加RNase A即可。(使用前 ， 用多少取多少 ， 放置37 ° C孵化5 ~ 10min)

3）环境温度低时Buffer II中SDS可能会析出出现浑浊或者沉淀，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清，不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。

4）避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

 

注意事项

 

1.所有的离心步骤如未加另外说明均在室温完成，使用转速可以达到12,000 x g，带50 mL转头的 台式离心机。

2.提取的质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb 的大质粒，应加大菌体使用量，同时按比例增加Buffer I、Buffer II、Buffer III 的用量，洗脱缓冲液应在70℃预热。可以适当的延长吸附和洗脱的时间，以增加提取效率。

3.得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。OD260值为1相当于大约50μg/mL DNA。电泳可能为单一条带，也可能为2条或者多条DNA条带，这主要是不同程度的超螺旋构象质粒泳动位置不一造成，与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。本公司产品正常操作情况下基本超螺旋可以超过90%。

4.质粒DNA确切分子大小， 必须酶切线性化后，对比DNA分子量Marker才可以知道。处于环状或者超螺旋状态的的质粒，泳动位置不确定，无法通过电泳知道其确切大小。

5.洗脱液EB不含有螯合剂EDTA，不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗脱，但应该确保pH大于7.5，pH过低影响洗脱效率。用水洗脱，质粒应该保存在－20℃。质粒DNA如果需要长期保存，可以用TE缓冲液洗脱（10mM Tris-HCl， 1mM EDTA，pH 8.0），但是EDTA可能影响下游酶切反应，使用时可以适当稀释。

 

使用方法

 

提示：

→第一次使用前请先在Buffer PW中加入84 mL无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!

→将RNase A加入Buffer I中，混匀，每次使用后置于2-8℃保存。

 

1、取100 ml-150ml（低拷贝200 ml-250ml）过夜培养的菌液加入离心管， 8,000 rpm 离心 3 min收集细菌，弃上清。

2、加入 10 ml Buffer I（请先检查是否已加入 RNase A），使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮沉淀。

3、加入 10 ml Buffer II，立即温和地上下翻转 6-8 次（不要剧烈震荡），使菌体充分裂解，室温放置 5 min。

4、向离心管中加入 10 ml Buffer III，立即温和地上下翻转 6-8次（溶液加完后应立即上下翻转，以避免产生局部沉淀），充分混匀，至溶液出现白色、分散絮状沉淀。室温放置 10 min后，再8,000 rpm 离心 10 min。

5、将步骤 4 的离心上清全部溶液转移至内毒素吸附过滤柱中（请避免倒入大量沉淀，以免阻塞过滤器），缓慢推动推柄过滤，滤液收集在干净的 50 mL 的管中。

6、向滤液中加入 0.3 倍滤液体积的Buffer PI，0.1倍滤液体积的 Buffer ER，上下颠倒混匀后转移到吸附柱中（吸附柱放入 50 ml 收集管中）。

注意：吸附柱的最大容积为 20 ml，所以需要分多次过柱。个别情况下离心机转子倾角较大，此时，建议加入吸附柱的溶液体积不超过 15 ml，以防产生漏液现象。

7、8,000 rpm 离心 2 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

8、向吸附柱中加入10mL去蛋白液 Buffer PB，8,000 rpm 离心 2 min。

9、 向吸附柱中加入10 ml  Buffer PW，8,000 rpm 离心 2 min，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中。

10、重复操作步骤9。

11、向吸附柱中加入 3 ml Buffer PE，室温 8,000 rpm 离心 2 min，弃废液。

12、将吸附柱重新放回收集管中，8,000 rpm 离心 5 min，以去除残余的漂洗液。

13、打开吸附柱盖子，置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

14、将吸附柱置于干净的 50 ml 收集管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加 1-2 ml Buffer TE，室温放置 2 min，然后 8,000 rpm 离心 2 min。将离心下来的质粒 DNA 全部移入到干净的 1.5 ml 离心管，-20℃保存。