HighSpeed Plasmid Mini Kit超速质粒

产品描述

      本试剂盒采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞，10 min可完成单个或多个样品的抽提工作，离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低pH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后低盐、高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。

 

产品特点

1.离心吸附柱内硅基质膜采用进口的特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，可重复性好。

2.快速、方便，不需要使用有毒的ben酚、氯仿等试剂，也不需要乙醇沉淀。获得的质粒产量高、纯度好， 可以直接用于酶切、转化、PCR、体外转录、测序等各种分子生物学实验。

 

运输和保存方法

1、RNase A保存在即用型甘油缓冲液中，常温运输，收到后，不超过25℃室温至少保存6个月，4℃保存12个月，长期保存放-20℃。

2、第一次使用时，将试剂盒所带的全部RNase A加入Buffer P1后（终浓度100ug/ml）置于2-8℃保存。如果Buffer P1中RNase A失活，提取的质粒可能会有微量RNA残留，在Buffer P1中补加RNase A即可。 (使用前 ， 用多少取多少 ， 放置37 ° C孵化5 ~ 10min)

3、环境温度低时Buffer P2中SDS可能会析出浑浊或者沉淀，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清，不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。

4、避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。

 

产品组分

 

试剂盒组分	保存	100T	200T
RNase A（10mg/ml）	4℃	300μL	600μL
Buffer P1	4℃	30mL	60mL
Buffer P2	室温	30mL	60mL
Buffer P3	室温	30mL	60mL
Buffer PB	室温	60mL	120mL
Buffer PE	室温	26mL 第一次使用前按说明加指定量乙醇	52mL 第一次使用前按说明加指定量乙醇
Buffer EB	室温	30mL	60mL
吸附柱和收集管	室温	100套	200套

 

 

注意事项

1、所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13,000rpm的传统台式离心机，如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。

2、提取质粒的量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。一般高拷贝质粒，建议接种单菌落于1.5-4.5 ml加合适抗生素的LB培养基， 过夜培养14-16个小时，可提取出多达20µg-50µg的纯净质粒。如果所提质粒为低拷贝质粒或大于10kb的大质粒，应适当加大菌体使用量，使用5-10 ml过夜培养物，同时按比例增加P1、P2、P3的用量，其它步骤相同。

3、得到的质粒DNA可用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测浓度与纯度。OD₂₆₀值为1相当于大约50μg/ml DNA。电泳可能为单一条带，也可能为2条或者多条DNA条带，这主要是不同程度的超螺旋构象质粒泳动位置不一造成，与提取物培养时间长短、提取时操作剧烈程度等有关。本公司产品正常操作情况下基本超螺旋可以超过90%。

4、质粒DNA确切分子大小， 必须酶切线性化后，对比DNA分子量Marker才可以知道。处于环状或者超螺旋状态的的质粒，泳动位置不确定，无法通过电泳知道其确切大小。

5、洗脱液EB不含有螯合剂EDTA，不影响下游酶切、连接等反应。也可以使用水洗脱，但应该确保pH大于7.5，pH过低影响洗脱效率。用水洗脱质粒应该保存在－20℃。质粒DNA如果需要长期保存，可以用TE缓冲液洗脱（10mM Tris-HCl， 1mM EDTA，pH 8.0），但是EDTA可能影响下游酶切反应，使用时可以适当稀释。

6.本产品仅作科研用途！

 

使用方法

提示：

→第一次使用前请先在Buffer PE中加入指定量无水乙醇，充分混匀，加入后请及时在方框打钩标记已加入乙醇，以免多次加入!

→将RNase A全部加入溶液P1中，混匀，每次使用后置于2-8℃保存。

 

提示：

第一次使用前请先在Buffer PE瓶中加入指定量无水乙醇，充分混匀，作好标记，以免多次加入!

将RNase A全部加入Buffer P1中，混匀，每次使用后置于2-8℃保存。

1、取1.5-4.5 mL过夜培养的菌液，12,000 rpm离心30秒，尽可能的倒干上清，收集菌体。

2、用250μL的Buffer P1重悬菌体沉淀，涡旋振荡至彻底悬浮。  

3、加250μL的Buffer P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解，室温放置4分钟。

4、加250μL的Buffer P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀时会出现白色絮状沉淀。12,000 rpm离心1分钟，小心取上清，避免吸取到漂浮白色沉淀。（注意：加入Buffer P3后应该立即混匀，以免产生SDS的局部沉淀。）

5、将上清加入到吸附柱中（吸附柱放入到收集管中），12,000 rpm离心30s，弃废液。

6、加入500μL的Buffer PB，12,000 rpm 离心30秒，弃废液。

7、加入600μL的Buffer PE（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000 rpm 离心30秒，弃掉废液。再次加入600μL的Buffer PE，12,000 rpm 离心30秒，弃掉废液。

8、将吸附柱放回空收集管中，12,000 rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液Buffer PE， 以免漂洗液Buffer PE中残留乙醇抑制下游反应。

9、取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加50-100μl洗脱缓冲液Buffer EB（洗脱缓冲液Buffer EB事先在 65-70℃水浴中加热效果更好），室温放置2分钟，12,000 rpm 离心1分钟，质粒收集在离心管中。

注意1：如果需要较多量质粒，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2分钟，离心1分钟。

注意2：洗脱体积越大，洗脱效率越高。如果需要质粒浓度较高，可以适当减少洗脱体积， 但是最小体积不应少于30μl，体积过小降低质粒洗脱效率，减少质粒产量。