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骆驼免疫纳米抗体文库构建服务介绍

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    卡梅德科技(KMD Bioscience)在抗体发现领域多年,能够为客户提供高质量的、骆驼来源的VHH抗体噬菌体展示文库制备服务。我们的科学家采用人用疫苗级别和生物制药的QbD(Quality by Design)设计原则,在理解和尊重ICH原则的基础上,设计并制备骆驼VHH抗体噬菌体展示文库,为客户提供全程可追溯的产品追溯体系和文件支撑体系,包括抗原设计,动物免疫,文库构建与筛选,功能验证等主要环节。

    传统意义上血清抗体主要包括IgG1,IgG2,IgG3和IgG4 四种亚型,而骆驼主要血清抗体包括IgG1,IgG2和IgG3三种类型,其中IgG1与传统抗体结构相似,含有2条重链和2条轻链;IgG2和IgG3缺少CH1和轻链结构域,因此也被称为重链抗体(heavy Chain Antibody,hcAb)。

    重链抗体(单域抗体)在羊驼和骆驼血清中的分部是不均衡的,骆驼血清抗体中重链抗体占比约为60-75%,羊驼血清抗体中重链抗体占比约为40-50%。这种显著的差异导致了构建的骆驼VHH抗体文库(骆驼纳米抗体文库)具有先天的优势,如表1所示。骆驼抗体文库主要是指利用骆驼重链抗体的可变区,即VHH区域序列构建的VHH抗体文库,又叫纳米抗体文库。VHH抗体(单域抗体)的特点是只含有重链抗体的抗原结合区,如图2所示,氨基酸长度约为110AA,SDS-PAGE显示分子量约为15kDa(远小于传统抗体150kDa的分子量),具有较好的稳定性,能够抵抗低pH环境。 同时在VHH人源化改造方面,也具有良好的适应性,容易满足Car-T等免疫细胞的改造和分选实验要求。

    卡梅德科技(KMD Bioscience)能够为客户提供高质量的、骆驼来源的纳米抗体噬菌体展示文库制备服务。我们坚持采用人用疫苗和生物制药的QbD(Quality by Design)设计原则,在理解和尊重ICH原则的基础上,设计并制备骆驼VHH抗体噬菌体展示文库,为客户提供全程可追溯的产品追溯体系和文件支撑体系。VHH抗体噬菌体展示文库包含抗原设计,动物免疫,文库构建与筛选等主要环节。

     

    VHH抗体噬菌体展示文库-抗原设计

    针对骆驼VHH抗体文库,我们设计了一系列来自于骆驼抗体Fc融合表达的人源免疫检查点蛋白。结合我们成熟的Freestyle 293F和Expi CHO细胞悬浮表达平台,我们能够为客户在较短的周期内从基因合成,载体构建到克隆蛋白的表达,更多的服务需求,请咨询我们的蛋白表达平台。同时,根据我们的实验结果,我们发现小分子靶蛋白直接与人源Fc片段融合后免疫效果要好于靶蛋白融合骆驼Fc片段后免疫结果(具体实验结果,请联系我们的技术人员)。

     

    VHH抗体噬菌体展示文库之文库构建与筛选

    卡梅德科技(KMD Bioscience)的骆驼种群来源于欧洲,公司可以提供未经免疫的,足龄(24-36月龄)的骆驼进行抗原免疫,按照标准免疫方法,每个项目免疫5-6针,免疫期间为客户提供ELISA效价测定服务,保证抗血清ELISA效价合格后采血分离PBMC。

    卡梅德科技(KMD Bioscience)采用M13噬菌体的pIII蛋白进行VHH抗体(纳米抗体)表面展示。我们的科学家构建了带有Flag和6*His tag双标签的噬菌体载体,同时制备出了具有10^8转染效率的TG1和XL1-Blue宿主菌感受态,经过2-3次转染与扩增,能够为客户提供有效库容量为10^8-10^9,且包装库容为10^13-10^16/ml颗粒数的高质量纳米抗体展示文库。通过抗原极限施压筛选方式,经过3轮纳米抗体文库淘筛,即可获得多达20-30株具有高亲和力的噬菌体株。通过简单的IPTG诱导,即可在1-2周内获得大量抗体表达产物,以满足客户FACS,细胞活性测试等研究需求。

     

    产品细节图片1

     

    驼源抗体文库制备-项目流程

    ​步骤 服务内容 周期
    Step1:动物免疫 * 准备1只健康、足龄双峰驼(28-36月龄) 6-8周
    * 免疫骆驼5-6次
    * ELISA检测血清效价,效价满足要求后取外周血;若效价不满足要求,则终止试验
    Step2:抗体cDNA制备(客户可以直接提供细胞,从此步开始) * 总RNA提取 3-4周
    * 高保真RT-PCR制备cDNA
    Step3:构建驼源抗体库 * 引物设计与合成:抗体可变区兼并引物设计、合成
    * 以cDNA为模板,PCR扩增重链抗体基因可变区
    * 噬粒构建与转化:酶切、连接噬菌粒载体,电击转化TG1宿主菌,构建抗体库
    * 鉴定:随机挑选96个克隆,PCR鉴定阳性率
    * 包装,>1⨯10^13 /ml噬菌体颗粒
    Step4: 文库淘筛 * 抗原极限施压法进行3轮淘筛  3-4周
    (3轮) * 鉴定:随机挑选96个克隆,ELISA效价测定
      * 多达96个阳性克隆进行基因测序,挑选10-15个克隆进行原核表达转化
      * 10-15个阳性克隆表达制备VHH抗体上清
    交付 * 驼源抗体文库的构建与筛选报告,包括测序报告,图片数据
    * VHH抗体文库2ml,>1⨯10^13 /ml噬菌体颗粒
    * 10-15个阳性克隆表达制备VHH抗体上清
    * 10-15个阳性克隆表达菌种

    注:1.客户提供骆驼外周血淋巴细胞,淋巴结细胞或脾脏细胞(保存在RNA later等溶液中,避免RNA降解,蓝冰运输),从第二步开始制备VHH抗体文库,只需3-4周即可完成。

    2. 采用TriZol溶液制备细胞裂解物,干冰运输。

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    图标文献和实验
    该产品被引用文献

    [1] Muyldermans S. Single domain camel antibodies: current status. J. Biotechnol. 2001 Jun;74(4):277-302.

    [2] Goldman ER, Anderson GP, Zabetakis D, et al. Llama-derived single domain antibodies specific for Abrus agglutinin. Toxins (Basel). 2011 Nov;3(11):1405-19.

    [3] Jones ML, Alfaleh MA, Kumble S, et al. Targeting membrane proteins for antibody discovery using phage display. Sci. Rep. 2016 May 18;6:26240.

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    • 纳米抗体开发及案例分享

      表达 表达时易形成包涵体,互相沾粘聚集沉淀。 表达量高,表达的抗体具有高水溶性,易复性。 抗体稳定性 易失活,高温或极度PH下失效或分解 高稳定性,高耐性,90℃处理后依然保持较高的活性 免疫原性 较高 较低 组织穿透力 较低 较高,可穿透血脑屏障 半衰期 较长 较短,血清清除速度快 纳米抗体序列优化纳米抗体 VHH

    • 纳米抗体,很小又很「重」

      骆驼科动物外周血液中存在一种天然缺失轻链的抗体,该抗体只包含一个重链可变区(VHH)和两个常规的 CH2 与 CH3 区,不像人工改造的单链抗体片段 (scFv) 那样容易相互沾粘,甚至聚集成块。单独克隆并表达出来的 VHH 结构具有与原重链抗体相当的结构稳定性以及与抗原的结合活性,是目前已知的可结合目标抗原的最小单位。VHH 晶体为 2.5nm,长 4nm,分子量只有 15KDa,由于其尺寸处于纳米级别,也被称作纳米抗体(Nanobody,Nb),听名字就很牛 B

    • 兔单抗开发及案例分享

      ,鼠单抗已从单纯的生物实验室科研及临床诊断发展到治疗性抗体药物。目前的抗体药物大多来源于小鼠或噬菌体展示库。2019 年 3 月,首个骆驼纳米抗体 Cablivi 获得 FDA 批准上市。2019 年 10 月,迎来首个兔单抗药物 Beovu,是抗体药物发展历程中的一个里程碑。临床使用的大多数治疗用抗体均需进行体外亲和力成熟,以提高抗体的亲和力。这一过程耗时长(8-12 个月),最终亲和力在 10-9mol/L。而兔单抗不需经体外亲和力成熟,就能达到 10-11 至 10-13mol/L。另外,兔

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