七色多重免疫荧光(六标七色)技术服务

多重荧光免疫组化--TSA 技术

基于酪胺信号放大（TSA）技术 ，多重荧光免疫组化（ mIHC）利用抗原抗体反应对样 本中多种蛋白标志物进行染色标记 ，实现在同一组织切片上多个靶标蛋白共同染色（最 多可实现数十种蛋白的共染色），从而通过荧光图像分析挖掘组织微环境中的复杂信息 ， 如定量分析、共表达确定细胞分型、空间关系分析等等。

一、技术原理

酪酰胺信号放大(TSA ，Tyramide signal amplification)技术是一类利用辣根过氧化酶 （ HRP）对靶蛋白或核酸进行高密度原位标记的酶学检测方法。荧光标记的酪胺分子在 H2O2 环境下被二抗标记的 HRP 催化激活 ，产生大量的酶促反应 ，使荧光素在抗原- 抗体结合部位与组织周围的蛋白残基结合 ，形成大量的荧光素沉积 ，实现信号放大。

TSA 技术原理是荧光染料与抗原直接结合 ，通过热处理或微波处理可洗脱一抗和二抗并 同时保留与组织抗原共价结合的荧光素。因此可以通过使用不同的偶联染料多次循环实 验对多种蛋白抗原进行荧光标记 ，实现一张组织切片上多个蛋白的共染色。

二、优势

①TSA 技术可使荧光放大信号大幅增强 ，大约是普通荧光的 3~10 倍。

 

②一抗抗体的种属来源不限。

 

普通荧光免疫组化共染的不同靶标要求一抗抗体是不同的种属来源 ，而 TSA 技术每一 轮染色后可以把上一轮的一抗和二抗洗掉 ，对后一轮染色无影响 ，因此同一种属来源的 一抗并不影响实验结果。

③实验过程中无需严格避光 ，因荧光素稳定不容易淬灭 ，实验操作过程中即使没有避光 也不影响实验结果 ，且染色后的玻片可以保存数月不淬灭 ，仍可以重新扫描。

三、实验步骤

1.脱蜡和水化

将切片组织依次放入烘箱内烤片 1h →二甲苯 Ⅰ15min → 二甲苯Ⅱ15min →无水乙醇 Ⅰ5min→无水乙醇Ⅱ

2.抗原修复

根据一抗选择合适的修复液（酸性的柠檬酸钠缓冲液或碱性的 Tris-EDTA 缓冲液），将 切片组织浸没于修复液中加热至沸腾 ，中低火维持 20 min， 自然冷却至室温。

用 PBS 洗涤三次 ，每次 4 min。切片组织放入 3%过氧化氢水溶液中 ，孵育 15 min。 用 PBS 洗涤三次 ，每次 4 min。

4.封闭

在组织周围画阻水圈（防止抗体流走），在圈内加入血清封闭  10min。

5.一抗孵育

轻轻甩去封闭液 ，在圈内滴加一抗工作液覆盖组织 ，于湿盒内 4℃孵育过夜或者  37℃ 1~2h。

6.二抗孵育

用 PBS 洗涤三次 ，每次 4 min。圈内加入配置好的 HRP 标记二抗（与一抗相应种属）， 避光室温孵育 30min。

7. TSA 荧光染料反应

用 PBS 洗涤三次 ，每次 4 min。圈内滴加 TSA 工作液孵育 10min。PBS 洗涤三次，每 次 4 min。

8、重复  2-7 步骤（选择对应的 TSA 荧光染料）

9、DAPI 细胞核染色

PBS 洗涤三次 ，每次 4 min。圈内滴加 DAPI 抗淬灭染液孵育 10min。

10、 封片

PBS 洗涤三次 ，每次 4 min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。

11、使用荧光扫描仪对玻片组织进行全景扫描 ，扫描图片可永久保存。

四、注意事项

①染料充分溶解混匀 ，有的试剂盒是有机溶性 ，如有沉淀 ，一定要先过滤。

 

②实验过程中避免切片干燥 ，并注意避免强光照射。

③选择特异性高的一抗抗体 ，优先单克隆。

④表达高的一抗搭配弱光 ，表达低的搭配强光。

⑤实验前做好方案设计 ，确定好染色顺序、修复条件 ，以及每个抗体搭配的荧光染料。