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★服务内容:
1.温和条件下进行蛋白抽提, BCA 定量,调整蛋白浓度;
2.样品预处理:用 Protein A / G Sepharose 孵育(进行 WB 验证可以免此步骤);
3.样品与 P 抗体进行孵育,之后加入 Protein A / G - Agarose 进行孵育;
4.洗涤 Protein ANG Sepharose - Antibody - Protein complex ,并对免疫复合物进行变性处理;
5.沉淀产物 SDS - PAGE 或者 WB 鉴定,质谱鉴定由客户自行确定;
6. Western blot 检测:
a )电泳:聚丙 烯 酰 胺 凝胶( SDS - PAGE )分离蛋白样品;
b )湿法转印( BLOTING : Tank Transfer );
c )杂交:用抗体鉴定膜上的特定蛋白( INCUBATION : Antibody );
d )化学发光检测( ECL ),胶片曝光。
7.预实验及正式实验服务。

★需要提供的信息:
1.新鲜或正确保存的样品:
a )细胞>1x10^7:组织>100mg:细菌湿重>1mg :植物>100mg;血清>50ul。
b )样品蛋白浓度> 1mg / ml ,蛋白量>200ug/样品。
2.目的蛋白一抗,空白或者阴性同种属 IgG。
3.阳性对照样品(尽量提供)。
4.相关文献(可选)。
★服务周期:
3-4周。
★结果内容:
1. 预实验曝光结果(胶片及扫描图),预实验采取2个一抗稀释度;
2.正式实验曝光结果(胶片及扫描图);
3.完整实验报告;
4. IOD 值分析报告(可选)。
★实验须知:
1.待检测样品可以是待检测蛋白样品,也可以是细胞、组织等其他样品;
2.免疫沉淀用抗体;
3.检测用抗体;
4.特异性二抗;
5.对照设置:由客户提供
a )空白:无抗体,只有 protein A / G;
b )阴性对照:无蛋白,有抗体及 protein A / G;
c )阴性对照:未转染细胞或者基因敲除样品;
d )对应的无关空白抗体:Normal IgG;
e )蛋白裂解液上清:Input。
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文献和实验酶活性。因此,添加蛋白酶抑制剂对于防止目的蛋白的降解从而完成免疫沉淀实验非常关键。一般主要通过添加EDTA抑制金属蛋白酶,通过Protease Cocktail(多种蛋白酶抑制剂混合物)可以抑制蛋白酶。 5. 去垢剂对于免疫沉淀实验尤其是免疫共沉淀实验是一个非常关键的因素。不同的去垢剂种类和不同的去垢剂浓度主要通过影响以下三个因素来影响免疫沉淀效果: (1)细胞质/器膜的通透性:因为许多目的蛋白都定位在细胞器中,所以必须先将这些蛋白释放出来,抗体才能与之反应。 (2) 膜蛋白的释放:许多膜蛋白
原理 免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是利用抗原和抗体的特异性结合以及 Protein A 或 G 特异性地结合到抗体的Fc 片段的现象探测两个蛋白分子间是否存在相互作用的一种方法。在细胞裂解液中加入针对蛋白M的抗体,孵育后再加入Protein A 或 G 预处理的 Sepharose 珠,若细胞中有与蛋白M结合的蛋白 N,就可以形成这样一种复合物:“蛋白 N-蛋白M—抗蛋白 M 抗体—Protein A 或 G—Sepharose 珠”,经 SDS
免疫沉淀(immunoprecipitation)与免疫共沉淀(coimmunoprecipitation)
一、概述 免疫沉淀(immunoprecipitation)是指利用抗体可与抗原特异性结合的特性,将抗原(常为靶蛋白)从混合体系沉淀下来,初步分离靶蛋白的一种方法。 免疫共沉淀(coimmunoprecipitation)是一种在体外探测两个蛋白分子间是否存在特异性相互作用的一种方法。其原理非常简单,如果两个蛋白在体外体系能够发生特异性相互作用的话,那么当用一种蛋白的抗体进行免疫沉淀时,另一个蛋白也会被同时沉淀下来。与酵母
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