- ￥15000
- miniD0001,环状双链
- 南京
- 2025年12月19日
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- 详细信息
- 技术资料
- 提供商：
宜明生物
- 服务名称：
minicircle DNA synthesis and purification
一、服务概述
minicircle DNA（微环 DNA）synthesis and purification 服务，专注于去除细菌复制原点（ori）、抗生素抗性基因等原核骨架序列，仅保留真核表达元件（如启动子、目的基因、polyA 尾）的环状 DNA 的定制合成与高纯度纯化，为基因治疗、细胞工程、疫苗研发等领域的科研机构与生物医药企业，提供从序列设计、专项制备到严格质控的一站式解决方案。
minicircle DNA 凭借 “无原核骨架干扰、转染效率高、长期表达稳定、免疫原性低” 的核心优势，可作为非病毒基因递送载体，在体外细胞重编程、体内基因治疗（如肝脏、肌肉靶向治疗）、基因编辑工具递送等场景中替代传统质粒 DNA，解决原核序列引发的免疫反应、表达沉默等问题。本服务针对 minicircle DNA 环化效率低、易残留亲本质粒、超螺旋比例难把控等技术痛点，采用定制化环化体系与多步纯化工艺，高效合成高活性 minicircle DNA，结合多维度质控（如超螺旋率检测、体内表达验证）确保产品满足临床前研究、产业级生产等严苛需求，助力客户突破非病毒基因递送载体应用技术瓶颈。
二、核心优势
1. 真核元件精准设计，剔除原核骨架干扰
针对 minicircle DNA 需去除原核序列、聚焦真核表达的特性，建立专业序列设计平台：
- 元件优化整合：根据客户需求（如基因治疗靶点、细胞重编程因子），精准整合真核表达元件（如 CMV、EF1α 启动子，bGH polyA 尾，绝缘子序列），剔除细菌 ori、抗性基因等原核骨架（片段长度缩短 40%-60%），避免原核序列引发的 TLR9 介导的免疫反应、染色质沉默等问题，使目的基因表达水平较传统质粒提升 2-5 倍；
- 环化位点设计：在真核元件两侧设计特异性重组位点（如 φC31 整合酶识别位点），优化位点间距与碱基组成，确保环化效率提升 50% 以上，同时避免重组过程中目的基因片段缺失、突变；
- 安全性验证：通过碱基替换、甲基化修饰等策略降低免疫原性，同时验证目的基因与真核元件的兼容性，避免启动子泄漏、终止信号异常等问题。
2. 高效环化与超螺旋富集，保障递送效率
针对传统环化方法超螺旋比例低、亲本质粒残留高的痛点，研发 minicircle DNA 专属环化与富集体系：
- 酶促环化优化：采用高活性位点特异性重组酶（如 φC31、Cre 重组酶，活性提升 80%），搭配环化促进缓冲液（含重组酶辅助因子、DNA 拓扑异构酶），使超螺旋 minicircle DNA 比例≥90%，较传统方法降低开环、线性杂质 60% 以上；
- 亲本质粒去除：通过 “限制性酶切 ” 法去除亲本质粒（含原核骨架的环状 DNA）：先用特异性限制酶切割亲本质粒的原核骨架区域（minicircle DNA 无该酶切位点），残留率＜0.1%，远低于行业标准（＜1%）；
3. 分级纯化工艺，严控杂质与污染物
针对 minicircle DNA 易混杂亲本质粒、酶切片段、内毒素的特性，采用 “酶切 - 纯化 - 脱盐 - 内毒素去除” 四级纯化策略：
- 酶切消化：通过限制性酶切线性化亲本质粒后，去除线性片段、酶蛋白等杂质，初步纯化纯度达 92% 以上；
- 超滤脱盐与内毒素去除：使用 30kDa 截留分子量的超滤膜去除盐类、小分子杂质，同时采用内毒素特异性吸附树脂（如 polymyxin B 树脂）去除内毒素，最终产品内毒素含量、核酸酶残留量低，满足动物体内注射、临床前细胞治疗等高标准需求。
4. 全流程质控，聚焦安全性与表达活性
建立覆盖 “合成 - 环化 - 纯化 - 应用” 全流程的专项质控体系，确保产品质量与功能：
- 结构完整性检测：通过琼脂糖凝胶电泳（1% 碱性胶）与高效液相色谱（HPLC，采用超螺旋 DNA 专用柱）检测超螺旋率（≥95%）、亲本质粒残留（＜0.1%）；通过 Sanger 测序或 NGS 验证目的基因序列准确性（错配率＜1×10⁻⁶）；
- 功能活性验证：体外转染 HEK293T、原代细胞（如肝细胞），通过 qPCR、Western blot 检测目的基因表达水平（较传统质粒提升 2 倍以上）
- 安全性检测：通过显色法测定试剂盒验证内毒素含量；通过加速稳定性实验（37℃储存 7 天、-20℃储存 6 个月）监测超螺旋率变化（下降＜5%），确保产品长期储存稳定性。每批次产品提供详尽质检报告，批次间性能差异＜3%，为实验结果的可重复性提供保障。
5. 灵活交付与快速支持
配备 minicircle DNA 专项生产与质控团队，标准订单20个工作日内完成交付（超长链 minicircle DNA＞10kb 需额外10个工作日），加急订单最快15个工作日内出具产物。
三、服务规格与交付内容
1. 服务规格
| 服务项目 | 服务详情 |
| 合成类型 | 基因治疗载体型 minicircle DNA、细胞重编程型 minicircle DNA、疫苗抗原表达型 minicircle DNA、基因编辑工具递送型 minicircle DNA |
| 合成长度 | 1-15kb（常规），支持＞15kb 超长链 minicircle DNA 定制（需提前评估可行性） |
| 修饰选项 | 5' 端：生物素标记、荧光标记（FAM/Cy3）；链内修饰：CpG 甲基化（降低免疫原性）、锁核酸（LNA，增强稳定性）；元件修饰：绝缘子序列添加（增强表达稳定性） |
| 产量范围 | 1μg-10g（可根据需求定制 GMP 级公斤级生产） |
| 适配场景 | 临床前基因治疗（肝脏、肌肉、肺部靶向）、iPSC 重编程、CAR-T 细胞基因编辑、DNA 疫苗研发、体外细胞功能研究 |
2. 检测项目
| 检测内容 | 周期 |
| Endotoxin assay | 一周 |
| BioBurden | 两周 |
3. 交付内容
- 高纯度 minicircle DNA 样本：无菌无酶低吸附离心管 / 试剂瓶分装（50-1000μL / 管，产业订单可提供 10-50mL GMP 级试剂瓶包装），干冰运输，-20℃储存可稳定保存 6 个月，-80℃储存可稳定保存 24 个月以上（建议分装后避免反复冻融）；
- 完整质检报告：根据客户需求可提供包含浓度 / 纯度数据（Nanodrop 与 Qubit 检测结果）、超螺旋率检测图谱（HPLC 与凝胶电泳图）、亲本质粒残留检测报告（qPCR 定量数据）、内毒素与核酸酶残留检测报告、体外 / 体内表达验证数据（qPCR Ct 值、Western blot 灰度分析、动物体内荧光成像图）；
- 使用指南：涵盖 minicircle DNA 溶解方法（推荐使用无酶 TE 缓冲液或生理盐水，温和混匀）、转染 / 注射条件建议（如脂质体转染比例、尾静脉注射剂量）、储存与稳定性说明、常见问题解决方案（如超螺旋解旋应对、表达量异常恢复方法）；
- 合规性文件：针对临床前 / 产业客户，根据客户需求可提供包含原料溯源报告、生产工艺流程图、质量体系文件（如 ISO 9001、GMP 相关记录），方便客户用于项目申报、成果转化。
四、应用场景
1. 临床前基因治疗研究
作为非病毒基因递送载体，minicircle DNA 可用于单基因遗传病、慢性疾病的临床前治疗研究。例如，在血友病 B 治疗中，携带人凝血因子 IX（hFIX）基因的 minicircle DNA，通过尾静脉注射小鼠后，肝脏靶向表达 hFIX，表达持续时间＞4 周，凝血功能恢复率达 80% 以上，且无明显免疫反应；在肌肉萎缩症治疗中，携带抗肌萎缩蛋白（DMD）基因的 minicircle DNA，通过肌肉局部注射可实现长期表达，改善肌肉功能。
2. 细胞工程与重编程
用于 iPSC 重编程、CAR-T 细胞基因编辑等细胞工程场景。例如，在 iPSC 重编程中，携带 Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc 四因子的 minicircle DNA，转染成纤维细胞后重编程效率较传统质粒提升 3 倍，且无原核序列整合风险，重编程细胞核型正常率≥98%；在 CAR-T 细胞制备中，携带 CAR 基因的 minicircle DNA，通过电穿孔递送可实现 CAR 稳定表达，T 细胞杀伤活性较病毒载体递送提升 20%，且避免病毒整合导致的致癌风险。
3. DNA 疫苗研发
作为 DNA 疫苗载体，minicircle DNA 可携带病毒抗原基因（如新冠 S 蛋白、流感 HA 蛋白），通过肌肉注射或皮内注射诱导免疫应答。例如，在新冠 DNA 疫苗研发中，minicircle DNA 携带 S 蛋白三聚体基因，免疫小鼠后产生的中和抗体滴度较传统质粒提升 3-5 倍，且细胞免疫应答（IFN-γ 分泌 T 细胞比例）显著增强，同时无原核序列引发的免疫副反应。
4. 体外细胞功能研究
用于体外细胞基因过表达、信号通路调控等研究。例如，在肿瘤细胞功能研究中，携带抑癌基因（如 p53）的 minicircle DNA，转染肿瘤细胞后可高效恢复 p53 表达，诱导肿瘤细胞凋亡率提升 40%，且无原核序列干扰，实验结果更接近体内真实生理状态；在神经细胞研究中，携带神经营养因子（如 BDNF）的 minicircle DNA，转染神经元后可长期促进神经突起生长，支持神经修复机制研究。
五、服务流程与技术支持
1. 服务流程
- 需求沟通：客户提供 minicircle DNA 的功能需求（如基因治疗靶点、细胞类型）、目的基因序列、表达元件偏好及产量要求，技术团队提供序列设计方案（含元件选择、环化位点设计）、安全性评估报告及方案报价；
- 序列确认与制备：客户确认序列后，构建含真核元件与原核骨架的亲本质粒，通过酶促环化生成 minicircle DNA，同步优化环化与纯化条件；
- 纯化与质控：完成环化后进行四级纯化，开展全流程质控检测（含体外 / 体内活性验证）；
- 交付与售后：质检合格后，产品与报告同步交付，提供后续实验技术支持。
2. 技术支持
- 专业咨询：提供 minicircle DNA 序列设计（如启动子选择、元件兼容性分析）、实验方案设计（如转染方法选择、动物注射剂量确定）、数据分析建议（如体内表达定量方法、免疫应答检测），协助解决环化效率低、表达量不达预期等问题；
- 问题解决：针对产品超螺旋率下降、体内表达不稳定等问题，提供 troubleshooting 方案（如调整储存条件、优化环化酶用量、添加绝缘子序列）；
- 定制化培训：为客户团队提供 minicircle DNA 合成与应用相关培训，包括环化技术原理、纯化工艺、体内外活性验证实验（如动物注射操作、流式细胞术检测）等，提升客户自主实验能力。
minicircle DNA synthesis and purification 服务以 “高安全性、高表达效率、高稳定性” 为核心，通过专项技术优化与严格质控，为非病毒基因递送领域提供高质量产品与专业服务，助力科研人员与企业突破 minicircle DNA 合成及应用技术瓶颈，加速基因治疗、细胞工程与疫苗研发的临床转化进程。
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