Invitrogen 人Cot-1 DNA™ 1527901

一、产品概述

人Cot-1 DNA™ 通常用于封闭微阵列筛选中的非特异性杂交。它还可用于抑制重复DNA序列，以直接映射人DNA或将基因组克隆映射至体细胞杂交组合，从而通过Southern印迹实现染色体定位。人Cot-1 DNA™ 是体细胞杂交文库和流式分选染色体文库（使用体细胞杂交构建）的有效文库筛选探针。
人 Cot-1 DNA™ 是一种胎盘DNA，大小主要在50至300 bp 范围内，且富含重复 DNA 序列（如 Alu 和 Kpn 家族成员）。每个包装的提供量足以用于 5–10 次 Southern 或500次原位杂交。

二、产品特性与优势

1. 高特异性封闭：通过富集中度重复序列（占人基因组约 30%），高效阻断探针与非靶标重复序列的结合，减少背景信号，提升杂交实验灵敏度。
2. 优化的制备工艺：经严格的 DNA 提取、片段化（平均长度~500 bp）、纯化和灭菌处理，确保无 RNA、蛋白质和其他污染物，保证实验一致性。
3. 广泛适用性：适用于多种分子杂交技术，包括荧光原位杂交（FISH）、比较基因组杂交（CGH）、Southern 印迹杂交、芯片杂交（如微阵列 CGH）等。
4. 即用型设计：产品为无菌水溶液（1 mg/mL），无需额外处理，可直接稀释后用于实验，简化操作流程。

三、性能和质量检测

琼脂糖凝胶电泳验证纯度和DNA大小。采用分光光度法，通过在50 mM NaOH中以1：100的比例稀释人Cot-1 DNA™并使用转换因子0.033μg/μL/A260 验证浓度。其他用于测定浓度的方法可能会产生不同的结果。

四、应用领域

· 荧光原位杂交（FISH）：用于染色体异常检测（如染色体易位、缺失、重复），提高信号特异性。
· 比较基因组杂交（CGH）：辅助基因组拷贝数变异（CNV）分析，减少非特异性杂交干扰。
· 基因芯片杂交：作为封闭试剂，降低芯片背景噪音，增强靶标探针信号强度。
· Southern/Northern 印迹杂交：抑制探针与基因组中重复序列的非特异性结合，提升结果清晰度。

五、产品规格

六、内容与储存

1.该DNA以1mg/mL溶液形式提供，溶剂为10mM Tris-HCl（pH 值 7.4）、1mM EDTA。
2.储存条件：-20°C 避光保存，避免反复冻融（建议分装后保存）；保质期见产品标签。
3.运输条件：湿冰或干冰运输，收到后立即存放于-20°C。

七、Cot-1 DNA®抑制探针的制备

获得有效抑制重复DNA序列杂交所需的Cot-1 DNA®的最佳量将取决于具体应用、探针DNA的类型和数量。对于某些探针，可能需要通过增加Cot-1 DNA中的探针滴定量或延长预杂交时间来建立最佳抑制。

（1）原位杂交 ：
人Cot-1 DNA®可在0.1μg/μl至1.0μg/μl范围内使用，建议初始实验采用0.1μg/μl。文献（3-6）中可找到使用不同探针的原位杂交方法的更多描述。
1.将标记探针DNA和Cot-1 DNA®混合，加入1/10体积的3M醋酸钠（pH 5.5）和2体积乙醇。将试管置于在-70°C下孵育30分钟或在-20°C下过夜。离心试管，去除乙醇，用70%乙醇洗涤，并干燥沉淀。或者，人Cot-1 DNA® 可单独通过乙醇沉淀浓缩至10mg/ml，并可直接加入杂交溶液中。
2.将DNA溶于50%甲酰胺、2X SSC和10%硫酸葡聚糖中，并充分涡旋混匀。
3.在70°C下加热以使探针/Cot-1DNA®混合物变性5分钟。
4.在37°C下孵育探针/Cot-1DNA®混合物20分钟。
5.将载玻片置于70%甲酰胺的2X SSC中，于70°C下孵育2分钟，使中期染色体变性。
6.添加探针/Cot-1DNA®混合物，施加盖玻片，用橡胶胶密封，并在适当温度下杂交（通常为37°C，但可能需要针对所使用的特定探针进行优化）。
7. 使用适合检测方法（荧光、酶或放射性检测）的程序清洗并处理载玻片。

（2）过滤器杂交：
1.在探针（质粒、λ、cosmid、YAC) DNA完成标记后，将反应产物通过1毫升Sephadex® G-50层离管以1500×g离心2分钟，以去除未结合的核苷酸。使用TE缓冲液[10 mM Tris-HCl（7.4）和1 mMEDTA]将探针终体积调整至100μl。
2.通过乙醇沉淀将Cot-1 DNA®浓缩（以1 mg/ml的浓度提供）至10 mg/ml。移取所需量的Cot-1 DNA® ，加入1/10体积的3 M醋酸钠溶液（pH5.5）和2倍体积的乙醇。混合后置于干冰/乙醇浴中冷却10分钟，然后离心。干燥沉淀物并用TE缓冲液重悬至原始体积的1/10（使人类Cot-1 DNA®的最终浓度为10 mg/ml)。
3.向标记探针（100μl中的25至500ngDNA）中加入5μl浓缩的未标记Cot-1 DNA®（50μg）、50μl 20X SSC、25μl水和20μl 1%（w/v）SDS，并充分混合。
4.通过将试管放入沸水中煮沸5分钟，对Denature探针/Cot-1DNA®混合物进行染色。
5.将试管(s)转移至65°C水浴中，孵育至少20分钟。
6.将探针/Cot-1DNA®混合液加入（一个或多个）过滤器中。

八、常见问题解答

1.在杂交过程中，我应该使用多少 COT-1 DNA 来抑制重复序列？
对于 Southern 印迹杂交，将 50 μg COT-1 DNA（10 μg/μL）加入 50 μL 20X SSC、25 μL 蒸馏水和 20 μL 含有 0.1 M NaCl、0.1 M Tris-HCl （pH 7.4） 的溶液中。每 25 至 500 ng 探针 0.01 M EDTA 和 1% SDS 到探针。对于原位杂交，将基因组探针与适量的COT-1 DNA结合，使COT-1 DNA的最终浓度为0.3μg/μL，用于粘粒，质粒和lambda探针;或者，对于 Alu PCR 探针，浓度为 1 μg/μL。乙醇沉淀并重悬于半体积的 100% 甲酰胺中。在 2X SSC（预热至 75 摄氏度）中加入半体积的 20% 葡聚糖硫酸盐并充分混合。通过加热至75°C5分钟使混合物变性。在 37 摄氏度下孵育 5 至 15 分钟。

2.如何标记 COT-1 DNA？
探针可以通过随机引物 DNA 标记系统（Cat.No.18187-013）或 Nick 翻译系统（Cat.No. 18160-010）通过随机引物或切口翻译程序用 32P 标记探针。生物素化 COT-1 DNA 可以通过 BioNick 标记系统（Cat.No. 18247-015）或 BioPrime DNA 标记系统（Cat.No. 18094-011）通过切口翻译制备。当 COT-1 DNA 首次连接到自身以提供最佳模板时，可以获得更好的结果。

3.我应该使用哪种 Cot-1 DNA 封闭试剂产品进行 aCGH 微阵列实验和 FISH 检测？
人 Cot-DNA-荧光 QC 已通过荧光法进行定量;这为高分子量产品提供了更准确的浓度测量。当需要阻断重复的小鼠 DNA 时，建议使用 Mouse Cot-1 DNA 封闭试剂进行实验。

4.Cot-1 DNA 封闭试剂如何发挥作用？
当添加到杂交溶液中时，Cot-1 DNA 封闭试剂可阻断重复序列，例如 SINE（短散布元件）、LINE（长穿插元件）和同一基因家族成员之间的序列同源性。

5.Cot-1 DNA 封闭试剂为我的 aCGH 微阵列实验或 FISH 检测提供了哪些优势？
由于交叉杂交的减少，使用 Cot-1 DNA 封闭试剂时可以获得更好的结果，从而实现更清洁、更灵敏的 aCGH 微阵列实验和 FISH 测定。