蛋白质免疫印迹（Western Blot）

一、技术定义与原理​
​免疫印迹（Western Blot, WB）​​ 是一种基于抗原-抗体特异性结合的高灵敏度蛋白检测技术。其核心技术融合了：
1.SDS-PAGE凝胶电泳​：按分子量分离蛋白质；
2.固相免疫分析​：将分离蛋白转印至膜载体（如PVDF/NC膜）；
3.免疫杂交​：利用一抗识别靶蛋白，酶标二抗放大信号，实现目标蛋白的定性、半定量及定位分析​。
​核心优势​：
​高分辨率​：可区分分子量相差5%的蛋白（如磷酸化与非磷酸化形式）；
​高特异性​：抗原-抗体结合避免交叉反应；
​广泛适用性​：适用于细胞、组织、血清等多种样本的靶蛋白鉴定。

​二、标准化实验流程与技术要点​
​1. 样本制备与定量​
​蛋白抽提​：
细胞样本：裂解液（含SDS、蛋白酶抑制剂）冰上裂解 → 12,000×g离心取上清；
组织样本：液氮研磨后匀浆 → 离心去除碎片。
​蛋白定量​：BCA法测定浓度，保证上样量一致（细胞样品10μg，组织样品20μg）。
​2. SDS-PAGE电泳分离​
​凝胶配制​：
分离胶浓度：依目标蛋白分子量调整（如10%胶适用于50-100kDa蛋白）；
浓缩胶浓度：5%（压缩样品成窄条带）。
​电泳参数​：
浓缩胶：80V电压，40min；
分离胶：120V电压，50min（溴酚蓝跑至胶底部终止）。
​3. 蛋白转印与封闭​
​转印方法​：
​湿转法​：200mA恒流转印2.5-3h（适用于＞100kDa大蛋白）；
​半干转法​：20V恒压转印20-60min（适用于30-100kDa蛋白）。
​膜封闭​：5%脱脂奶粉/TBST溶液室温封闭1h（磷酸化蛋白检测需改用5% BSA）。
​4. 抗体孵育与检测​
​一抗孵育​：4℃过夜（稀释比例依抗体效价优化）；
​二抗孵育​：HRP标记二抗室温孵育2h（推荐1:4000稀释）；
​信号检测​：ECL化学发光法，X光胶片或成像系统采集信号。
​5. 数据分析与质控​
​内参校正​：GAPDH/β-actin作为负载对照，计算靶蛋白相对表达量（公式：靶蛋白灰度值/内参灰度值）；
​灰度分析​：ImageJ软件定量条带强度，避免饱和曝光（过曝条带灰度值＞65,535时失效）。