Immobilon®-E PVDF转印膜预切片膜, 0.45

Western Blot详解－常见的问题指南（二）

  4. 滤纸、胶和膜的问题 X. NC膜\ PVDF膜\ 尼龙膜怎样鉴别？ 解答：尼龙膜是较理想的核酸固相支持物，有多种类型；硝酸纤维素膜是目前应用最广的一种固相支持物，价格最便宜；PVDF膜介于二者之间。 就结合能力而言：尼龙膜结合DNA和RNA能力可达480－600μg/cm2，可结合短至10bp的核酸片段；硝酸纤维素膜结合DNA和RNA能力可达80－100μg/cm2，对于200bp的核酸片段结合能力不强；PVDF膜结合DNA和RNA能力可达125－300

蛋白质印迹与探测(Western Blot)

强度，若高背景确由二抗产生，可适当降低二抗浓度或缩短二抗孵育时间；并考虑延长每一步的清洗时间。 5． 一抗与二抗的稀释度、作用时间和温度对检测不同的蛋白要求不同，须经预实验确定最佳条件。 6. 一般情况使用0.45μm的NC膜，0.1～0.2μm的小孔径膜只适合于分子量小于20kD的蛋白质。 7. PVDF尼龙膜较NC膜柔软、结实、灵敏度高，易于操作且蛋白质结合能力强（PVDF膜可结合蛋白质480μg/cm2，而NC膜只能结合蛋白质80μg/cm2）；缺点是PVDF尼龙膜背景

Western实验步骤

培养液、蛋白酶抑制剂等）及其他干扰物质；b. 样品浓度应适中，1×SDS凝胶加样缓冲液建议用量：贴壁细胞按10cm2培养皿/0.1ml,悬浮细胞按5×106细胞/0.1ml比例加入；c. SDS对蛋白质变性和电泳分离至关重要，浓度应控制在2-10%之间，并根据具体需要调整；d. 制备好的样品可以在-20℃保存，但时间不宜过长，并避免反复冻融，否则蛋白会发生降解；e. 内参对实验结果至关重要，应选择合适的内参。二、电泳电泳分为非变形凝胶电泳和变性凝胶电泳，Western Blotting中常用的是不连续缓冲