品牌：简石生物
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- 详细信息
- 文献和实验
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充足
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- 供应商：
简石生物
- 规格：
2次
产品特点：
- 独有的显色反应，可直接观察到细胞裂解中和的程度，极大地方便操作者判断其状态。
- 快速、方便，不需要使用有毒的苯.酚、氯.仿等试剂，也不需要乙醇沉淀。获得的质粒产量高、纯度好，内毒素含量极低（≤0.1EU/µg），可以直接用于酶切、转化、PCR、体外转录、测序、转染、体内细胞等各种敏感的分子生物学实验。
- 此产品仅供科研使用。
- DNA纯度：获得的质粒产量高、纯度好，可以直接用于酶切、转化、PCR、体外转录、测序、转染等各种分子生物学实验。一般情况Abs260/280≥1.8，Abs260/230 ≥ 2.0，内毒素含≤0.1EU/µg 。
- 质粒DNA产量：每次可提取到约1~3mg，主要依据质粒的拷贝数，培养物的培养环境等因素。
- 质粒DNA大小：最高可达200kb。（片段长度与菌种相关）
- 洗脱体积：≥600µl。
- 操作温度：室温（15-30°C）。
- 操作时间：≤25分钟
- 第一次使用时，将试剂盒所带的全部RNase A加入溶液P1后（终浓度~100μg/ml）充分混匀后置于4℃保存。如果溶液P1中RNase A失活，提取的质粒可能会有微量RNA残留，在溶液P1中补加RNase A即可。
- 试用装的质粒DNA洗涤液2请按照瓶体标注乙醇体积添加。
质粒DNA洗涤液2应添加48ml无水乙醇到12ml的质粒DNA洗涤液2中。
加入后请及时在方框打钩标记，以免多次加入 ! - P3在使用前需要预先在冰上冷却。
- 准备预冷过的异丙醇备用。
操作步骤：
- 取300ml过夜培养的菌液，OD值≤5，在≥5000xg离心力下离心5分钟，尽可能地倒干上清，收集菌体。
- 用21ml溶液P1重悬菌体沉淀，可用吸头反复吹打或涡旋振荡至彻底悬浮。
（如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低。） - 加21ml的溶液P2，温和地上下颠倒8次使菌体充分裂解，室温放置≤5分钟。
（温和地混合，不要剧烈振荡，以免基因组DNA剪切断裂！所用时间不应超过5分钟！以免质粒受到破坏。此时菌液应变得清亮粘稠，如果菌体少，很快清亮粘稠后就可以做下一步。） - 加21ml预冷过的溶液P3，温和地上下颠倒8次或者更多次，直到中和完全后，会出现白色絮状沉淀。（中和物应蓬松均匀，无黏性团状等状态，中和完全后溶液呈现黄色），在≥ 5000xg离心力下离心5分钟。
-
将一个50ml离心管放在离心管架子上准备收集过滤液，然后把注射器下端的接头拧开并将上一步上清慢慢倒入注射器内，将注射器推杆推入注射器内慢慢推动收集过滤液（大约会收集到35ml左右的过滤液）。
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在上述混合液中加入0.6~0.8倍预冷过的异丙醇，盖上盖子颠倒数次使其充分混匀。以下步骤可以通过真空负压的方式也可以通过离心的方式进行操作（负压设备所用真空多联器推荐简石生物公司产品）
负压操作步骤：
- 确认5号PX纯化柱（连接15ml和50ml漏斗）连接紧密后放置在负压多联器上，倒入第6步的混合液，打开真空开关使液体完全通过纯化柱。
- 去掉50ml漏斗。
- 关掉真空开关，倒入3ml质粒洗涤液1到15ml漏斗内，打开真空开关，让液体完全通过纯化柱。
- 关掉真空开关，加入5ml质粒DNA洗涤液2（请先检查是否已加入无水乙醇!）到15ml漏斗内，打开真空开关让液体完全通过纯化柱。
- 去掉15ml漏斗，将5号PX纯化柱套在2ml收集管上，然后放置在台式离心机上在≥10000xg条件下空转2分钟以去除残留乙醇。
- 将5号PX纯化柱套在一个干净的1.5ml离心管内，添加600-800µl的质粒DNA洗脱液到纯化柱质上，（洗脱液事先在65-70℃水浴中预热，洗脱效果更好），室温放置2分钟，在≥10000xg条件下离心1分钟来洗脱质粒DNA。
推荐：将洗脱后的DNA加回到纯化柱基质上，进行二次洗脱可以提高产量。
- 确认5号PX纯化柱（连接15ml漏斗）连接紧密后放置在一个50ml离心管里，倒入第6步的混合液，1000xg离心力下离心2分钟，倒掉离心管中的混合液，重复此步骤直到过滤液全部倒净。
- 加入3ml质粒DNA洗涤液1，1000xg离心力下离心2分钟，弃掉废液。
- 加入5ml质粒DNA洗涤液2（请先检查是否已加入无水乙醇!），1000xg离心力下离心2分钟，弃掉废液。
- 去掉15ml漏斗，将5号PX纯化柱套在2ml收集管上，然后放置在台式离心机上在≥10000xg条件下空转2分钟以去除残留乙醇。
- 将5号PX纯化柱套在一个干净的1.5ml离心管内，添加600-800µl的质粒DNA洗脱液到纯化柱基质上，（洗脱液事先在65-70℃水浴中预热，洗脱效果更好），室温放置2分钟，在≥10000xg条件下离心1分钟来洗脱质粒DNA。
推荐：将洗脱后的DNA加回到纯化柱基质上，进行二次洗脱可以提高产量。
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文献和实验，不能得到足够的菌量来抽提质粒，摇菌时间一般 12-14 小时为宜。 ③质粒属于低拷贝类型，导致收集的细菌量过少。 ④提取时菌量过多：容易导致裂解不充分，且容易超过硅胶膜柱的承载上限，最终使得质粒提取效率降低，建议参考提取试剂盒建议的菌液量来提取。 ⑤质粒提取实验操作不当：比如在加入缓冲液重悬菌体时，菌体没有充分分散悬浮，导致后续裂解不充分。为指示菌体是否充分裂解，可以考虑在重悬缓冲液中加入指示剂（QIAGEN 质粒提取试剂盒中均有配备 LyseBlue 指示剂），均匀蓝色指示悬浮充分。 ⑥试剂使用
盒包括柱离心式DNA胶回收及PCR产物快速纯化试剂盒、柱离心式质粒小量快速抽提试剂盒、柱离心式高纯质粒小量快速抽提试剂盒、 柱离心式去内毒素超纯质粒小量快速抽提试剂盒、 质粒抽提、DNA胶回收、PCR产物纯化柱离心式多用途小量纯化试剂盒、柱离心式质粒中量抽提试剂盒 、柱离心式高纯度质粒中量抽提试剂盒、 柱离心式去内毒素超纯质粒中量抽提试剂盒 、核酸纯化小柱（质粒小抽、胶回收）、核酸纯化大柱（质粒中抽、大抽）等10个产品。 现因公司产品结构调整，转让该系列试剂盒的配方、生产工艺、生产设备。包教
程度等等。 现在大部分质粒提取都用试剂盒， 根据实验需要我们可以选择不同级别的产品： 1. 从纯度上看：常规操作（如酶切、PCR、测序、文库筛选、连接和转化），普通纯度的质粒即可；对于转染实验，则需要无内毒素质粒提取试剂盒。 2. 从提取量上看：1-20μg，小量提取试剂盒；20-40μg，中量提取试剂盒；大于40μg，大量提取试剂盒。 3. 宿主菌类别上：主要分为普通细菌质粒提取试剂盒，真菌质粒提取试剂盒，酵母菌质粒提取试剂盒。 举例：SunShinecleanTM无内毒素质粒小量抽提试剂盒采用新型
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