核酵母双杂交点对点试剂盒

实验原理

酵母核体系双杂交技术是基于对真核细胞转录因子特别是酵母转录因子GAL4性质的研究，GAL4包括两个结构域，即DNA结合结构域(DNA-binding domain，BD)和转录激活结构域(Activating domain,AD)。BD能够识别位于GAL4效应基因(GAL4-responsive gene)的上游激活序列(Upstream activating sequence，UAS)并与之结合，AD可以启动UAS下游的基因进行转录。BD和AD分别单独作用并不能激活转录，但是当二者在空间上充分接近时，则呈现完整的GAL4转录因子活性并可激活UAS下游启动子，转录启动子下游基因并使其表达。

Y2HGold菌株是GAL4系统酵母双杂实验用菌株，可直接转化质粒进行蛋白互作验证。Y2HGold-GAL4酵母双杂系统需要两种质粒配套使用：pGBKT7和pGADT7。质粒pGBKT7的筛选标志为TRP1，用于表达BD(来自酵母转录因子GAL4 N端1~174位氨基酸)与目标蛋白(Bait)的融合蛋白;质粒pGADT7的筛选标志为LEU，用于表达AD(GAL4 C端768~881位氨基酸)与目标蛋白(Prey)的融合蛋白。本试剂盒提供的产品包含了酵母双杂验证过程中用到的各种培养基以及酵母转化试剂，操作简单，能用于10对双杂的互作验证(质粒需自行扩繁)。

产品优势

1.采用多个筛选步骤，可以减少非特异性相互作用的假阳性结果。
2.每个环节均有严格的质控，实验效率更高。
3.可处理复杂样本，同时筛选和鉴定多个蛋白质间的相互作用，实现高通量的筛选和分析。
4.使用操作简便，更易上手。
5.性价比高:试剂配套齐全，价格优惠，低于市面上同款产品。

实验流程

诱饵及猎物质粒构建及提取
制备Y2H Gold酵母感受态细胞
诱饵蛋白自激活及毒性检测
共转化验证
稀释点种

结果展示

稀释点种验证

1：Y2H[pGBKT7-A + pGADT7 ]（自激活）

2：Y2H[pGBKT7-A + pGADT7-B ]（实验组）

+：Y2H[pGBKT7-53 + pGADT7-T]（阳性对照组）

 -：Y2H[pGBKT7-lam + pGADT7-T]（阴性对照组）

常见问题与解答

Ql:酵母杂交发生假阳性的原因及解决方式?
产生原因:
(1)由于BD融合诱饵蛋白有单独激活作用，或者其激活作用被外来蛋白激活。
(2)AD融合靶蛋白如果有DNA的特异性结合，也可以单独激活报告基因的表达。
(3)BD和AD在文库中会有随机碰撞导致空间上的接近，以致下游报告基因的表达。

解决方法:
(1)对于点对点验证来说，可同时将诱饵和猎物进行自激活验证，减少假阳性的判定，但是一旦诱饵和猎物均产生自激活，后续自激活的处理方式(截短)会浪费较多的时间;
(2)由于每个报告基因上游的调控区各不相同，因此用不同的报告基因验证阳性，可用于排除或减少假阳性，这也是我们主要采取的方式;
(3)单杂启动子，我们主要采用将报告基因整合到酵母的染色体上，可以使基因表达水平稳定，消除了由于质粒拷贝数变化引起的基因表达水平的波动而造成的假阳性。

Q2:如果诱饵可以直接激活报告基因，该如何处理?
为保证诱饵蛋白功能的完整性，首先我们会考虑用3’AT/ABA进行背景抑制，但是由于这两种试剂对酵母生长具有较大的毒性，后续可能会影响文库筛选，因此在3'AT超过15mM，ABA超过1200ng/mL时我们会考虑将诱饵蛋白进行截断，通过查阅文献和相关数据库，截去转录激活的区域，但是需要注意的是，截去的这一部分很有可能会影响到互作结果。

Q3:如何从验证结果判断两个蛋白是否互作及互作强度?
酵母核双杂点对点验证是根据是否激活3个报告基因(MELI、HIS、Ade2)来反推是否有互作，是否激活了报告基因又是根据涂布相应平板的颜色反应及菌落有无及大小来判断，因此我们可以直接根据显蓝的强弱、TDO上斑的多少以及大小、QDO上是否能生长来初步判断互作的强弱。