膜酵母双杂交点对点试剂盒

实验原理

膜体系酵母双杂是基于分离的泛素(split-ubiquitin)介导的膜蛋白酵母双杂交系统，该系统可用于膜蛋白-膜蛋白或膜蛋白-胞质蛋白之间的互作检测。
泛素是一种含76个氨基酸的保守蛋白，它经常作为降解信号连接在蛋白质的N端。泛素能被其特异性的蛋白酶(ubiquitin-specific proteases, UBPs)识别并从所连接的蛋白上切割下来，切割位点总是位于泛素蛋白的C端。在酵母细胞中，泛素可以分成两部分单独表达，即其N端部分(NubI,第1~34位氨基酸)和C端部分(Cub,第35~76位氨基酸)，后者融合有能启动核内报告基因表达的LexA-VP16蛋白。

野生型NubI和Cub具有高亲和力，并且可以自发重组形成异源二聚体。但是当野生型NubI的第13位Ile被Ala或Gly取代后，NubI和Cub就不能自发结合，因此，NubG(I13G)和Cub-LexA-VP16只有依靠bait和prey相互作用进行连接形成完整的泛素分子，然后诱导UBPs识别并于其C端进行剪切，从而释放出转录因子LexA-VP16，最终启动核内报告基因(HIS3、ADE2、LacZ)的转录。

产品优势

1.采用多个筛选步骤，可以减少非特异性相互作用的假阳性结果。
2.每个环节均有严格的质控，实验效率更高。
3.可处理复杂样本，同时筛选和鉴定多个蛋白质间的相互作用，实现高通量的筛选和分析。
4.使用操作简便，更易上手。
5.性价比高: 试剂配套齐全，价格优惠，低于市面上同款产品。

实验流程

诱饵及猎物质粒构建、提取
制备NMY51酵母感受态细胞
诱饵重组质粒功能验证
诱饵蛋白自激活及毒性检测
共转化验证
稀释点种

结果展示

稀释点种验证

1：pBT3-A和pPR3-N（自激活）

2：pBT3-A和pOst1-NubI（功能验证）

3：pBT3-A和pPR3-N-B（实验组）

+：pTSU2-APP和pNubG-Fe65（阳性对照组）

-：pTSU2-APP和pPR3-N（阴性对照组）

常见问题与解答

Q1:膜体系为什么要做功能验证?怎样进行功能验证?
膜系统载体的选择主要根据诱饵跨膜的类型进行选择，为验证诱饵载体是否构建正确，能在细胞中形成正常的功能，需要将重组诱饵质粒和猎物载体pOST1-NubI共转化酵母菌株中，通过涂布缺陷型和报告基因平板，如果均生长，说明诱饵和猎物的功能域形成了完整的泛素，激活了报告基因的表达，诱饵构建无误，能够形成正常的定位和功能。

Q2:用筛出的阳性结果做点对点验证现阴性结果的原因是什么?
(1)酵母杂交本身也是存在假阳性的情况，有可能这两个基因根本不互作，合成全长进行验证自然也不会产生互作;
(2)对于双杂来说一般是两个结构域之间的互作，如果互作的两个基因的结构域恰好处于接触的状态，那么就可以发生相互作用;
(3)有些互作为瞬时互作，在文库筛选时可能捕捉导了互作，而在两个基因进行单独验证时就显示为阴性;
(4)有些互作为间接互作，可能需要依靠第三个基因的作用，促进这两个基因的互作;
(5)有些蛋白在正天然情况下可能为膜蛋白或者是定位在膜上的蛋白，酵母杂交虽然是模拟体内互作，但是与天然状态下的蛋白还是有一定的差距的，为保证两个蛋白在同一空间，诱饵和猎物载体均带有核定位信号，会强行的将他们定位在核内，因此可能会产生假阳性的情况。

Q3:筛出的阳性结果为什么需要重新合成全长而不是片段做回转验证?
(1)片段的序列是基于测序结果得出来的，可能会有突变和缺失的情况，可能不是一个完整的结构域;
(2)将阳性测序结果进行NCBI数据库检索时，由于为片段式可能会匹配到很多的基因，没有办法确定为哪一个基因，需要进行试验确认才能定位到具体的基因，在进行后续的辅助实验EMSA，pulldown等实验时才有理论依据，否则在发文章时仅凭不能确定基因的片段并不能作为有力的支撑。