甲基化怎么检测

DNA甲基化检测技术体系与研究进展

 

DNA甲基化作为表观遗传修饰的核心机制之一，其检测技术已成为解析基因表达调控、疾病发生机制及生物标志物开发的关键工具。甲基化怎么检测的核心在于对CpG二核苷酸中胞嘧啶5号碳位共价修饰的jīngzhǔn识别，当前技术体系可分为三大类：基于亚硫酸盐转化的单碱基分辨率检测、甲基化敏感限制性内切酶法和抗体/亲和富集法。亚硫酸盐处理通过将未甲基化胞嘧啶转化为niàomìdìng（后续PCR扩增时变为胸腺嘧啶），而甲基化胞嘧啶保持不变，由此产生的序列差异可通过测序或芯片进行定量分析，例如全基因组亚硫酸盐测序（WGBS）可实现全基因组单碱基分辨率图谱。甲基化敏感限制性内切酶（如HpaII/MspI）则通过酶切位点对甲基化状态的敏感性差异，结合PCR或微阵列实现靶向检测。抗体富集法则利用5-甲基胞嘧啶抗体或甲基结合域蛋白（MBD）捕获甲基化DNA片段，适用于大规模筛查但分辨率较低。甲基化怎么检测的技术选择需权衡覆盖度、分辨率、通量及成本，例如甲基化特异性PCR（MSP）适用于少量位点的临床验证，而简化代表性亚硫酸盐测序（RRBS）则在成本与覆盖度间取得平衡。

 

高分辨率检测技术

 

基于亚硫酸盐转化的测序技术是甲基化怎么检测的金标准。全基因组亚硫酸盐测序（WGBS）通过全基因组范围内所有CpG位点的单碱基定量，可发现未知的甲基化差异区域，但数据量庞大且成本较高。具体费用需要根据实验需求和样品情况来确定。靶向亚硫酸盐测序（如靶向panel或扩增子测序）通过富集特定基因区域显著降低成本，适用于验证候选位点。第三代测序技术（如PacBio SMRT和Oxford Nanopore）可直接检测甲基化修饰，无需亚硫酸盐处理，但当前准确度仍需优化。

 

中通量筛查技术

 

甲基化芯片（如Illumina Infinium MethylationEPIC）覆盖约85万个CpG位点，通过探针杂交与荧光信号检测实现中通量筛查，其标准化流程适合群体表观基因组研究。甲基化敏感高分辨率熔解曲线分析（MS-HRM）则通过PCR产物熔解特性差异区分甲基化状态，适用于临床样本快速检测。甲基化怎么检测在此类技术中需注意引物设计对亚硫酸盐转化DNA的兼容性，以及批次效应对芯片数据的潜在影响。

 

新兴技术与挑战

 

单细胞甲基化测序（scBS-seq）解决了细胞异质性问题，但建库复杂度高且数据稀疏。液体活检中的循环游离DNA甲基化检测（如ctDNA甲基化标志物）在癌症早筛中展现潜力，但需克服低浓度样本的技术噪声。纳米孔测序的实时甲基化检测为动态甲基化研究提供了新思路，其单分子长读长特性有助于解析等位基因特异性甲基化。

 

常见问题：

 

Q1. 亚硫酸盐转化不wánquán会如何影响甲基化检测结果？

A：转化不wánquán会导致假阳性甲基化信号，因残留的未转化胞嘧啶被误判为甲基化。可通过设置转化效率质控（如λDNA spike-in）和生物信息学校正（如Bismark的--non_directional模式）进行校准。

 

Q2. 不同组织或细胞类型的甲基化状态差异较大，如何选择参考基因组进行比对？

A：建议使用经亚硫酸盐处理的模拟转化参考基因组（如GRCh38_lambda），同时引入内参（如ERCC spike-in）评估技术偏差。跨组织比较时需校正细胞组成差异，可使用生物信息学工具（如RefFreeEWAS）进行去卷积分析。