甲基化分析流程

DNA甲基化分析流程的技术解析与实施要点

 

DNA甲基化作为表观遗传修饰的核心机制，通过胞嘧啶第五位碳原子的共价修饰调控基因表达，在发育调控、疾病发生和细胞分化中具有关键作用。甲基化分析流程的构建需要根据研究目标选择适当的技术路线，通常涵盖样本制备、DNA提取、文库构建、高通量测序或芯片检测、生物信息学分析等关键环节。全基因组甲基化分析（WGBS）通过亚硫酸氢盐处理将未甲基化的胞嘧啶转化为niàomìdìng，再结合二代测序实现单碱基分辨率；而靶向甲基化测序（如RRBS或靶向panel）则通过酶切富集或探针捕获显著降低测序成本。具体费用需要根据实验需求和样品情况来确定。

 

样本质量直接影响甲基化分析流程的可靠性，建议使用新鲜冷冻组织或经特殊稳定剂处理的样本，避免福尔马林固定导致的DNA降解和假阳性。DNA提取环节需严格控制RNA污染（RNAse处理）和dànbáizhì残留（酚氯仿纯化），浓度要求≥50 ng/μL（Qubit定量），片段完整性DV200＞50%。亚硫酸氢盐转化效率需通过spike-in对照（如Lambda DNA）验证，转化率＜95%的样本应排除。对于低起始量样本（如cfDNA），可采用单细胞甲基化建库技术（scBS-seq）或扩增优化方案（PBAT）。

 

生物信息学分析是甲基化分析流程的核心竞争力。原始数据需经过FastQC质控后，使用Bismark或BSMAP进行比对，甲基化位点提取需设定至少10×覆盖深度。差异甲基化区域（DMR）分析工具如DSS或methylKit需校正批次效应，同时考虑CpG岛、shore/shelf等基因组特征区域。整合转录组数据时，可采用MethylMix或ELMER等工具建立甲基化-表达调控网络。值得注意的是，不同组织或细胞类型的甲基化基准数据库（如ENCODE、BluePrint）对结果解读具有重要参考价值。

 

常见问题：

 

Q1. 如何区分亚硫酸氢盐转化不wánquán与5-羟甲基化（5hmC）的信号干扰？

A：常规亚硫酸氢盐处理无法区分5mC与5hmC，需结合氧化亚硫酸氢盐测序（oxBS-seq）或TET辅助重亚硫酸盐测序（TAB-seq）。前者通过KRuO4氧化将5hmC转化为5fC进而被转化为niàomìdìng，后者利用TET酶将5hmC转化为5caC保留测序信号。

 

Q2. 针对FFPE样本的甲基化分析有哪些特殊质控指标？

A：需额外检测FFPE修复效率，包括：① 脱嘌呤率（通过qPCR评估ΔCq值，阈值＜3）；② 甲醛交联导致的片段化程度（电泳主峰应＞150bp）；③ 使用FFPE专用修复酶（如NEBNext FFPE DNA Repair Mix）处理。建议平行检测FFPE-QC评分（如Illumina TSO500 panel指标）。

 

Q3. 单细胞甲基化数据如何解决等位基因特异性甲基化（ASM）的识别难题？

A：需整合单细胞SNP分型（如scTrio-seq2），通过亲本特异性单倍型定相区分。计算方法上，monovar等工具可校正扩增偏倚，而HMM-based模型（如scMethBank）能识别单细胞特异的甲基化单倍型区块（methylation haplotype blocks）。