石蜡包埋样本全转录组测序的不足

石蜡包埋样本全转录组测序的不足分析

石蜡包埋样本全转录组测序作为回顾性研究的重要工具，在利用临床存档样本进行基因表达分析时面临多重技术限制。样本经甲醛固定和石蜡包埋处理后，核酸分子会发生广泛的化学修饰，其中RNA的完整性受到显著影响。固定过程中形成的亚甲基桥交联导致RNA片段化，平均片段长度通常不足200 nt，这使得常规建库方法难以捕获全长转录本。更关键的是，石蜡包埋样本全转录组测序的不足还体现在碱基修饰上：甲醛介导的胞嘧啶脱氨作用会引入假性C>U突变，而氧化损伤则导致niǎopiàolíng转化为8-氧代niǎopiàolíng，这些变化在数据分析阶段可能被误判为真实变异。

从技术层面看，石蜡包埋样本全转录组测序的不足还包括建库效率的显著降低。由于RNA片段末端常带有单链缺口或3'-磷酸基团，需要额外的酶修复步骤才能连接接头，这一过程可能引入序列偏好性。实验成本方面，具体费用需要根据实验需求和样品情况来确定，但特殊建库试剂和额外的质控步骤通常会使单样本成本比新鲜样本提高30%-50%。数据质量上，石蜡包埋样本的转录组测序数据中通常存在3'端偏好性（>70% reads分布于zuì后两个外显子），这限制了可变剪接分析的准确性。

在生物信息学分析环节，石蜡包埋样本全转录组测序的不足表现为参考基因组比对率的下降。固定导致的交联会使RNA分子形成dànbáizhì-RNA复合物，这些复合物在提取过程中难以wánquán解离，zuì终导致测序reads中含有dànbáizhì序列残留。zuì新研究显示，这类样本的比对率比冻存样本低15-20个百分点。此外，批次效应在石蜡包埋样本中更为显著，不同固定时间（尤其超过24小时的样本）会形成dútè的降解指纹，这对多中心研究的整合分析提出严峻挑战。

常见问题：

Q1. 石蜡包埋样本中长非编码RNA（lncRNA）的检测灵敏度为何显著低于mRNA？

A：这与lncRNA的二级结构特性直接相关。多数lncRNA含有稳定的茎环结构，甲醛固定会加剧这些区域的交联，导致逆转录酶在延伸过程中频繁脱落。实验数据显示，>2kb的lncRNA在石蜡样本中的检出率不足新鲜样本的40%。

Q2. 如何校正石蜡包埋样本tèyǒu的GC含量偏差？

A：建议采用双管齐下的策略：实验上使用含5mM DTT的提取缓冲液破坏二硫键交联；分析时应用GC含量分段校正算法（如RSEM-GC），特别要注意GC含量>70%的转录本需单独建模。近期Nature Methods报道的FFPE-seq专用流程可降低GC偏差达60%。