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- 2025年08月05日
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北京百泰派克生物科技有限公司
- 服务名称：
外泌体western
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外泌体western技术在dànbáizhì表征研究中的应用进展
外泌体作为直径30-150 nm的细胞外囊泡，其表面及内部携带的dànbáizhì组成为研究细胞间通讯和疾病标志物的关键靶点。外泌体western通过特异性抗体识别技术，实现了对这些纳米级囊泡中低丰度蛋白的定性及半定量分析，已成为外泌体研究bùkěhuòquē的验证手段。该技术建立在超速离心或尺寸排阻色谱法分离的外泌体基础上，需通过BCA或纳米颗粒追踪分析确认样品纯度和浓度后，采用RIPA裂解液释放囊泡内蛋白，再经SDS-PAGE电泳分离和转膜处理。与传统western相比，外泌体western对转膜效率要求更高，推荐使用0.22 μm PVDF膜并结合甲醇活化步骤，以保障小于20 kDa的外泌体特征蛋白（如CD63、TSG101）的捕获率。实验设计中需特别注意排除血清源性外泌体干扰，建议使用无外泌体胎牛血清培养细胞或采用PBS洗涤三次的临床样本。具体费用需要根据实验需求和样品情况来确定。
在抗体选择方面，外泌体western需同时验证阳性标记物（Alix、HSP70）和阴性对照（Calnexin、GM130），以确认外泌体纯度。zuìxīn研究推荐使用跨膜蛋白CD9/CD81与胞质蛋白TSG101的组合验证，其检出灵敏度比单一标记物提高3-5倍。对于磷酸化蛋白检测，需在裂解液中添加磷酸酶抑制剂cocktail，并在冰上快速操作以避免蛋白降解。转印后采用5%脱脂牛奶封闭1小时可显著降低背景信号，但对糖基化蛋白（如EpCAM）建议改用3% BSA封闭。数据分析阶段需注意外泌体western的线性动态范围较窄，建议通过系列稀释确定zuìjiā上样量，通常10-30 μg蛋白/孔可获得理想信号。
外泌体western的技术难点在于样本异质性控制。近期《Journal of Extracellular Vesicles》提出的标准化流程建议：采用EXO-CET试剂盒富集外泌体后，用TMT标记联合质谱预筛候选蛋白，再针对目标蛋白设计western验证方案。该方法将假阳性率降低至8%以下。对于外泌体亚群分析，可先通过免疫磁珠分选（如CD63+）再进行western，但需注意抗体表位可能因外泌体膜结构折叠而被遮蔽。zuìxīn开发的数字化western系统（如ProteinSimple Wes）实现了飞克级检测限，特别适用于外泌体稀有位点突变蛋白（如EGFRvIII）的检测。
常见问题：
Q1. 外泌体western出现非特异性条带如何排查？
A：首先确认抗体特异性（敲除模型验证），其次检查裂解是否chèdǐ（建议超声辅助裂解），zuì后排除二抗交叉反应（使用同源物种IgG预吸附二抗）。膜洗涤时采用TBST（含0.1% Tween-20）比PBS更能减少非结合抗体残留。
Q2. 临床样本外泌体western内参如何选择？
A：避免使用β-actin/GAPDH等胞质蛋白，推荐跨膜蛋白CD9或CD81作内参。对于血浆样本，可额外检测ApoB-100排除脂蛋白污染。zuìxīn研究表明，外泌体通用标记蛋白Flotillin-2在不同病理状态下表达稳定，可作为补充内参。
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文献和实验间充质干细胞外泌体（MSC EXOs）近年来已经在伤口愈合、神经损伤、肝病以及新冠肺炎等领域被广泛研究应用。不少研究表明，在各种损伤和疾病模型中，MSC EXOs 可以作为间充质干细胞的替代选择。 第四军医大学去年就在干细胞领域权威期刊 Stem Cell Research & Therapy 发表文章 [1]，发现 MSC EXOs 逆转肝纤维化，是间充质干细胞（MSCs）治疗肝脏疾病的重要机制。MSC EXOs 正逐渐成为再生医疗领域的「新武器」，也为临床疾病研究提供新思路。
外泌体（Exosomes）作为当前科研界的热度话题，很多人觉得它很神秘，不知道它在疾病治疗或发生、发展中扮演什么样的角色，今天我们跟大家一起基于文献来探讨一下外泌体具有的功能。 先回顾一下外泌体的基础知识。外泌体是细胞分泌到胞外的一种囊泡（Extracellular Vesicles，EVs），其大小为 30-150 nm，具有双层膜结构和茶托状形态，含有丰富的内含物（包括核酸、蛋白和脂质等），参与细胞间的分子传递。 所有的细胞都能分泌外泌体，但是不同细胞分泌的外泌体不管在数量
细胞上清外泌体细胞上清外泌体提取图解过程 1.核对样本 2.离心，3000g，15min； 3.离心后样本（有略微沉淀） 4.将样本转移至新的 50ml 管并加 ECS 试剂; ECS 与试剂有明显分层； 震荡混匀； 5.在 4 度冰箱静置 2H 以上，离心 10000g，60min； 6.离心后的样本（沉淀明显，沉淀中富含外泌体） 将上清吸出留下沉淀，将离心管倒扣于纸上自然晾干残留的上清液； 7.加 PBS 重悬沉淀； 用 PBS 洗脱后的沉淀 8.离心进一步去除
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