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- 2026年01月04日
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上海达为科生物科技有限公司
- 服务名称：
大片段敲入
一、大片段敲入的定义与科学意义
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基本概念
大片段敲入指通过基因编辑技术，将长度 >200 bp 至数十 kb 的外源DNA序列（如报告基因、调控元件、功能基因簇）精确插入基因组特定位点，实现功能性修饰或表达调控。其核心挑战在于维持插入序列的完整性和精准性，同时避免基因组断裂（DSB）导致的脱靶效应。 -
与传统编辑技术的区别
- 小片段编辑：CRISPR/Cas9 可高效实现单碱基替换或短片段插入（<50 bp），但无法承载复杂基因元件。
- 大片段敲入：需克服DNA稳定性、同源重组效率低、修复路径选择等瓶颈，是基因功能研究和疾病模型构建的关键工具。
二、技术方法分类与效率优化
（一）主流技术路径比较
| 方法 | 原理 | 效率 | 局限性 | 适用场景 |
|---|---|---|---|---|
| 同源定向修复（HDR） | 利用同源臂模板（ssODN/dsDNA）引导修复，实现精准插入 | 低（<10%） | 依赖细胞周期（S/G2期），模板制备复杂 | 胚胎干细胞、小鼠受精卵 |
| 非同源末端连接（NHEJ） | 依赖DSB后NHEJ路径直接连接断裂端，可插入大片段但易产生indel | 中（20-40%） | 插入方向不可控，易引入突变 | 多拷贝基因敲除 |
| CRISPR相关转座酶（CAST） | 利用转座酶复合物（如Vch QCascade）在无DSB下催化DNA整合 | 高（>50%） | 需优化向导RNA设计，哺乳动物适配性待提升 | 哺乳动物细胞无痕插入 |
| 重组酶介导交换（RMCE） | 在基因组预置“着陆位点”，通过Cre/LoxP系统交换外源cassette | 极高（>80%） | 需预编辑基因组，步骤繁琐 | 条件性基因人源化小鼠模型 |
（二）效率提升关键策略
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同源臂优化：
- 单链DNA模板（ssODN）同源臂长度需 ≥400 nt，可使HEK293T细胞敲入效率达95%。
- 双链DNA模板结合 长同源臂（>1 kb） 可提升大片段（>5 kb）插入成功率。
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修复路径调控：
- 抑制NHEJ关键因子（如KU70/80）或激活HDR通路（如RS-1），可显著提高HDR效率。
- HMEJ（同源介导末端连接） 结合微同源臂与CRISPR切割，效率较传统HDR提升3-6倍。
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递送系统创新：
- AAV载体：将供体模板包装至AAV病毒，结合电穿孔递送CRISPR RNP，实现小鼠胚胎内 >10 kb 片段敲入。
- 长读长测序验证：使用Oxford Nanopore技术检测插入完整性，避免载体序列残留或重排。
三、核心应用场景与案例
（一）生物医学研究
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基因功能验证：
- 敲入 增强型绿色荧光蛋白（EGFP） 标签，实时追踪内源蛋白表达与定位。
- 大片段删除（>15 kb）验证铜绿假单胞菌III型分泌系统基因簇功能。
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疾病模型构建：
- 利用HDR在小鼠胚胎敲入 人类疾病相关突变（如Leber先天性失明基因LCA10），模拟病理机制。
- RMCE技术构建 条件性敲入模型，实现组织特异性基因表达调控。
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文献和实验keimon 要对MUT基因缺失的病进行检查，检测对象是个携带者，怀疑是大片段DNA缺失，求大片段外显子缺失的检查方法？ :D woxingwosu 呵呵，虽然不熟悉，我也来说说看法。 是否可以通过PCR基因组来判断呢？设计一对引物，其中一个引物要在这个大片段上面，然后从对象提取基因组，做PCR，再与正常的基因组比较得到差异？ 或者是通过提RNA,RT-PCR,最后在用这一对引物去检测与正常的差别
条件性基因敲除与敲入 在生理学研究中，为了明确某一组织或器官的功能，常将实验动物体内所要研究的组织或器官切除，进而根据实验动物的生理指标或功能的变化来推测切除部分的功能。生命科学发展到今天，人们对于生命现象的认识已经逐步深入到了分子水平，而上述的“部分切除―观察整体―推测功能”的研究思想仍然有效。具体地说，就是在分子水平破坏想要研究的基因，然后观察生物体的生理指标、功能、整体形态、组织结构、发育过程的变化等，进而推测相应基因的功能。这种研究过程称为基因敲除(gene knock
一般PCR方法在扩增大片段DNA时的局限性 通常所用的PCR方法都在两个方面有局限，即目标产物精确程度和合成片段的大小。Pfu（Pyrococcus furiosus）DNA聚合酶，具有完整的3‘外切酶校读活性（3'-editing-exonuclease），可以将每个循环中碱基的错配率由10*-4降到10*-3，从而提高PCR产物的准确性。但它在扩增1.5-2.0 kb 片段时，效率比Klentaq l（Taq DNA聚酶N-末端缺失突变体，类似于E.coli DNA
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