药物诱导基因敲除

一、核心系统及原理

1. 他莫昔芬（Tamoxifen）诱导系统

   • 原理：将Cre重组酶与突变型雌激素受体（ER-LBD）融合形成Cre-ER(Tam)融合蛋白。未给药时，该蛋白与热休克蛋白（HSP90）结合并滞留于细胞质；给药后，他莫昔芬与ER结合，释放Cre进入细胞核，介导loxP位点间的重组。
   • 优势：
     • 时间可控性强，避免胚胎期致死问题；
     • 高灵敏度版本（如Cre-ERT2）对4-OHT的敏感性提升10倍。

2. 四环素诱导系统（Tet-On/Tet-Off）

   • Tet-Off系统：无需四环素时，tTA蛋白激活Cre表达；给予多西环素（Dox）则抑制Cre活性，适用于持续敲除场景。
   • Tet-On系统：需Dox激活rtTA蛋白才能启动Cre表达，适用于短期诱导。
   • 应用：常用于发育阶段特异性基因功能研究，如肺上皮细胞基因敲除。

3. 干扰素诱导系统（Mx1-Cre）

   • 通过注射polyI:C或干扰素诱导Cre表达，适用于免疫细胞或肝脏等干扰素响应组织的研究。

二、实验设计流程

1. 构建Flox小鼠：在目标基因两侧插入loxP序列，确保基因正常功能不受影响。
2. 选择Cre工具鼠：根据实验需求选择组织特异性或药物诱导型Cre品系（如Alb-CreERT2用于肝脏特异性敲除）。
3. 药物处理：
   • 他莫昔芬：成年小鼠连续5天腹腔注射（75-100 mg/kg），溶解于玉米油或葵花籽油。
   • 多西环素：通过含药饲料（600 mg/kg）连续喂养14天。
4. 表型分析与验证：通过PCR、Western blot或荧光报告系统确认敲除效率。

三、应用场景

1. 疾病模型构建：如肿瘤研究中诱导性敲除致癌基因，观察肿瘤发生动态。
2. 发育生物学：研究特定发育阶段（如胚胎期或成年期）基因功能。
3. 组织特异性研究：结合组织特异性启动子（如神经元Nestin启动子），解析基因在特定细胞类型中的作用。

四、注意事项

1. 药物交叉污染：处理组与对照组需分笼饲养，避免他莫昔芬通过粪便交叉诱导。
2. 脱靶效应：部分Cre品系存在本底活性（如Cre-ERT2的泄露表达），需设置严格对照。
3. 剂量优化：药物浓度和给药频率需根据动物年龄、品系调整，避免毒性。