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- 上海
- 2026年01月12日
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伊莱博生物科技（上海）有限公司
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同源重组
一、定义与分子机制
同源重组是一种依赖DNA序列相似性（同源臂）的精准基因编辑技术，通过外源载体与宿主基因组间的序列交换实现靶向修饰。其核心机制包括：
- 同源臂介导的精准定位
- 外源载体两端设计≥1 kb的同源臂（与靶基因侧翼序列一致），引导载体与基因组特异性结合（避免随机插入）。
- DNA断裂修复与交换
- 内源核酸酶（如Cas9）或自发损伤诱导 双链断裂（DSB） → 细胞启动同源定向修复（HDR） → 以载体为模板合成新链，实现基因替换/插入。
- 关键分子参与者
- RecA/Rad51：介导DNA链配对与交换
- BRCA1/2：调控修复路径选择（HR vs. NHEJ）
生物学意义：HR是唯一能实现单碱基至大片段精准替换的自然修复机制，区别于易出错的非同源末端连接（NHEJ）。
二、技术流程与关键步骤
1. 载体设计策略
| 元件 | 功能 | 案例 |
|---|---|---|
| 长同源臂 | 提升重组效率（1-10 kb） | 小鼠基因敲除常用3 kb臂 |
| 正筛选标记 | 新霉素抗性（Neo^R）等，筛选重组细胞 | 中的"Selection"标记 |
| 负筛选标记 | HSV-TK（更昔洛韦敏感），淘汰随机插入细胞 | 中的Gancyclovir反选 |
| 条件性删除系统 | Cre/loxP或FLP/FRT，移除筛选标记 | 的LOXP重组 |
2. 细胞工程化改造
- 胚胎干细胞（ESC）打靶：
- 电穿孔导入线性化载体 → G418筛选阳性克隆
- PCR/Southern验证重组位点（避免随机整合）
- CRISPR-HR联用：
- Cas9切割靶位点 → 同步提供HR模板（效率提升50倍）
3. 动物模型构建流程
注：传统ESC/HR流程需6-12个月，CRISPR-HR可缩短至3个月。
三、应用场景与突破案例
1. 疾病模型构建
| 模型类型 | 技术方案 | 疾病研究价值 |
|---|---|---|
| 基因敲除小鼠 | HR替换致病基因为终止子 | 囊性纤维化、癌症机制研究 |
| 点突变模型 | HR引入特定SNP（如APOE4） | 阿尔茨海默症药物筛选 |
| 人源化模型 | HR插入人类基因片段（如IL-2） | 免疫治疗评估 |
2. 生物医药生产
- 治疗性蛋白载体：
- HR将人抗凝血酶III基因插入山羊β-酪蛋白位点 → 乳汁中表达药用蛋白（产量>1g/L）
- 基因治疗修复：
- HR修正β-珠蛋白突变 → 治疗β-地中海贫血（临床前阶段）
3. 合成生物学
- 染色体工程：
- Cre/loxP介导大片段重组 → 构建环形人工染色体（中的MI系统）
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文献和实验自杀性质粒载体：一般用于基因突变。将突变的目的基因克隆到自杀性质粒载体上，通过接合等使其进入宿主，由于在宿主菌中不存在复制基因启始所需的复制蛋白（如Pi蛋白等），其无法复制，在外界选择性压力的作用下,自杀性质粒载体所携带的突变基因就与宿主染色体上的野生型发生基因发生二次同源重组，产生了带有突变的突变株；而质粒载体自身由于自杀性特性连同染色体上原有的野生型基因一起随着细菌的传代从菌体内消失。至于一次重组的突变株，可借助质粒上的某些选择基因（如sacB，sucrose敏感）筛除。整合载体：将目的
同源重组技术原理： 基因敲除鼠技术是上世纪80 年代中后期基于DNA 同源重组的原理发展起来的，Capecchi 和Smithies 在1987 年根据同源重组（homologous recombination ）的原理，首次实现了ES 的外源基因的定点整合（targeted integration ），这一技术称为" 基因打靶" （gene targeting ）或" 基因敲除" （gene knockout ），利用这种ES 的显微注射就可以制作出基因敲出小鼠（KO Mice
同源重组基因转移法 同源重组 (homologous recombination)是将外源基因定位导人受体细胞染色体上的方法，因为在该座位有与导人基因同源的序列，通过单一或双交换，新基因片段可替换有缺陷的基因片段，达到修正缺陷基因的目的。位点特异性重组是发生在两条DNA链特异位点上的重组，重组的发生需一段同源序列即特异性位点(又称附着点；attachmentsite，att)和位点特异性的蛋白因子即重组酶参与催化。重组酶仅能催化特异性位点间的重组，因而重组具有特异性和高度
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