两个蛋白之间存在互作的方法

蛋白互作研究方法的技术解析

 

在分子生物学研究中，确认两个蛋白之间存在互作是解析细胞信号传导、代谢调控及疾病机制的关键环节。目前，多种实验技术可用于验证蛋白互作，每种方法各具优势，适用于不同的研究场景。

 

免疫共沉淀（Co-IP） 是一种经典的体内互作验证技术，其原理是利用特异性抗体捕获目标蛋白及其潜在互作伴侣，随后通过Western blot检测共沉淀蛋白。该方法能反映生理条件下的蛋白互作，但需注意抗体的特异性及细胞裂解条件对互作稳定性的影响。若需定量分析，可结合质谱技术进一步鉴定互作蛋白组，具体费用需要根据实验需求和样品情况来确定。

 

酵母双杂交系统（Y2H） 则通过重构转录因子活性来检测蛋白互作。将目标蛋白分别与DNA结合域（BD）和转录激活域（AD）融合，若两个蛋白之间存在互作，则激活报告基因表达。该系统适用于大规模筛选互作蛋白，但可能存在假阳性（如非生理性互作）或假阴性（如蛋白折叠异常）。

 

荧光共振能量转移（FRET） 通过供体荧光蛋白（如CFP）与受体荧光蛋白（如YFP）的能量转移效率判断蛋白互作，空间分辨率可达1-10 nm。该方法适用于实时监测活细胞内的动态互作，但对荧光蛋白标记可能干扰天然蛋白功能。

 

表面等离子共振（SPR） 和 生物层干涉仪（BLI） 可定量分析蛋白互作的动力学参数（如结合常数KD）。SPR通过检测芯片表面折射率变化反映结合事件，而BLI利用光干涉原理直接测量分子结合厚度。两者均需固定一种蛋白，具体费用需要根据实验需求和样品情况来确定。

 

交联质谱（XL-MS） 通过化学交联剂稳定蛋白复合物，结合质谱鉴定交联肽段，从而提供互作界面信息。该技术可解析难以结晶的蛋白复合物结构，但交联效率与质谱灵敏度是关键限制因素。

 

常见问题：

 

Q1. 如何区分直接互作与间接互作？

A：可通过体外重组蛋白结合实验（如GST pull-down）验证直接互作，或利用交联质谱锁定互作界面。间接互作需结合基因敲除/敲降技术排除桥梁蛋白影响。

 

Q2. 低丰度蛋白互作检测如何提高灵敏度？

A：建议采用邻近标记技术（如BioID或APEX），通过酶促标记邻近蛋白，富集后经质谱分析。此外，选择高亲和力抗体或优化荧光报告系统（如NanoLuc-Y2H）也可增强信号。