可用于检测两个蛋白质之间直接结合的方法有

检测dànbáizhì直接相互作用的实验方法体系

 

在分子生物学和生物化学研究中，验证两个dànbáizhì之间的直接结合是解析信号通路、复合物组装及功能机制的核心环节。目前可用于检测两个dànbáizhì之间直接结合的方法有包括多种基于不同原理的技术，其灵敏度和适用范围各异。

 

表面等离子共振（SPR） 通过实时监测靶蛋白固定在传感器芯片表面时引起的折射率变化，定量分析结合动力学参数（如Ka/Kd）。Biacore系列仪器可实现无标记检测，但需要高纯度蛋白样品。具体费用需要根据实验需求和样品情况来确定。该技术对分子量大于10 kDa的复合物分辨率较高，而小分子相互作用可能需结合其他方法验证。

 

等温滴定量热法（ITC） 直接测量结合过程中释放或吸收的热量，提供完整的热力学参数（ΔH、ΔS）。该方法无需标记或固定，但样品消耗量较大（通常需毫摩尔级浓度）。其优势在于可同时获得结合化学计量比和亲和力数据，特别适用于酶-底物或蛋白-小分子相互作用研究。

 

荧光共振能量转移（FRET） 利用供体-受体荧光基团（如CFP/YFP）在1-10 nm距离内的能量转移效率判断结合事件。该技术适用于活细胞内的实时动态观测，但需注意荧光蛋白标签可能干扰天然构象。时间分辨FRET（TR-FRET）可进一步降低背景噪声。

 

交联质谱（XL-MS） 通过化学交联剂共价连接相互作用蛋白，经质谱鉴定交联肽段以确定结合界面。该技术能捕获弱或瞬时的相互作用，分辨率可达氨基酸水平。交联剂选择（如DSS、BS3）和质谱参数优化是关键。

 

生物膜干涉技术（BLI） 基于光纤生物传感器检测蛋白结合引起的膜层厚度变化，操作简便且通量较高。Octet系统已广泛用于抗体-抗原筛选，但对溶液粘度敏感。

 

微量热泳动（MST） 通过红外激光诱导温度梯度，分析蛋白复合物在热泳动中的迁移率差异。仅需微量样品（4-20 μL），适合低溶解度蛋白，但需对至少一种蛋白进行荧光标记。

 

双分子荧光互补（BiFC） 将荧光蛋白分割为两个非活性片段，分别融合至目标蛋白，结合后重建荧光信号。适用于亚细胞定位研究，但存在不可逆结合的假阳性风险。

 

核磁共振（NMR） 通过化学位移扰动或NOE效应解析结合位点，尤其适合无序区域相互作用。需同位素标记（15N/13C）和高浓度样品，设备成本较高。

 

X射线晶体学 提供原子级分辨率的结构信息，但需获得高质量共结晶，成功率受蛋白特性影响显著。冷冻电镜（cryo-EM）对超大复合物更具优势。

 

常见问题：

Q1. 如何选择zuì适合检测弱亲和力（Kd >10 μM）蛋白互作的方法？

A：ITC和MST对弱结合的检测灵敏度较高，因其直接测量结合过程中的物理参数变化，且不受洗涤步骤干扰。若需动态监测，可选用高灵敏度SPR（如Biacore 8K）或反向FRET设计。

 

Q2. 交联质谱中如何区分特异性结合与非特异性交联？

A：需设置严格对照（如单独蛋白交联组），结合交联剂长度限制（通常＜30 Å）和质谱打分（如XlinkX软件）。交叉验证不同交联剂（如可裂解型DSSO）的结果可提高可靠性。