Screen Quest Fluo-8 去除培养基钙检测试剂

Screen Quest Fluo-8钙检测试剂盒是美国AAT Bioquest生产的钙检测试剂盒，钙通量测定是用于筛选G蛋白偶联受体（GPCR）的药物发现中的优选方法。 Screen Quest Fluo-8 NW钙测定试剂盒提供均匀的荧光测定，用于检测细胞内钙动员。表达感兴趣的GPCR的细胞通过钙预先加载我们专有的Fluo-8 NW，其可以穿过细胞膜。 Fluo-8 NW是可用于HTS筛选的亮钙指示剂。一旦进入细胞内，Fluo-8 NW的亲脂性阻断基团被非特异性细胞酯酶切割，产生带负电荷的荧光染料，其停留在细胞内，并且在与钙结合时其荧光大大增强。当用筛选化合物刺激细胞时，该受体表明细胞内钙的释放，这极大地增加了Fluo-8 NW的荧光。其长波长，高灵敏度和100-250倍荧光增加的特性（当它与钙形成复合物时）使Fluo-8 NW成为测量细胞钙的理想指标。这个Screen Quest Fluo-8 NW钙测定试剂盒提供了一种优化的检测方法，用于监测G蛋白偶联受体（GPCR）和钙通道。该测定可以以方便的96孔或384孔微量滴定板形式进行，并且易于适应自动化。，为您提供优质的Screen Quest Fluo-8 去除培养基钙检测试剂盒*适合于难检测细胞系*。 

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荧光酶标仪
Ex:	490 nm
Em：	525 nm
Cutoff：	515 nm
推荐孔板:	黑色透明底板
读取模式:	底部读取/分液处理

样品实验方案

简要概述

1.准备细胞
2.去除生长培养基
3.添加Fluo-8 NW染料工作溶液
4.在室温下孵育1小时
5.监测Ex / Em = 490 / 525nm处的荧光强度

 

溶液配制

1.储存溶液配制

除非另有说明，否则所有未使用的储备溶液应分成一次性等分试样，并在制备后储存在-20°C。 避免反复冻融循环。
1.1 Fluo-8 NW配制：
对于Cat No.36307，将10μLDMSO加入Fluo-8 NW（组分A）中，并充分混合。
对于Cat No.36308和36309，将100μLDMSO加入Fluo-8 NW（组分A）中，并充分混合。 注意：10μLFluo-8 NW原液足以容纳1个平板。

1.2分析缓冲液储备液（1X）：
对于Cat No.36307和36308，将9mL HHBS（组分C）加入10X Pluronic F127 Plus（1mL，组分B）中并充分混合。
对于Cat No.36309，将整瓶10XPluronic®F127Plus（10 mL，组分B）加入90 mL HHBS缓冲液（不包括在试剂盒中）中并充分混合。 注意：对于一个平板，10 mL的1X分析缓冲液就足够了。

 

2.工作溶液配制

将10μLFluo-8 NW DMSO储备溶液加入10mL 1X测定缓冲液中并充分混合。 该工作溶液在室温下稳定至少2小时。

 

操作步骤

1.有关细胞样品制备的指南，请点击查看。

2.从细胞板上除去生长培养基。注意：重要的是去除生长培养基，以大限度地减少背景荧光和化合物对血清或培养基的干扰。注意：或者，在含有0.5％至1％FBS的生长培养基中培养细胞，以避免培养基去除步骤。在这种情况下，需要在HHBS缓冲液中加入2X染料。 [我们为那些在生长培养基中使用0.5％至1％FBS以避免培养基去除步骤的人提供2个独立的无洗涤钙测定试剂盒（目录号36315和目录号36316）。

3.将100μL/孔（96孔板）或25μL/孔（384孔板）的Fluo-8NW染料工作溶液加入到细胞板中。

4.将染料加载板在细胞培养箱中孵育30分钟，然后在室温下将板孵育另外30分钟。注意：如果测定需要37°C，立即进行实验，无需进一步室温孵育。注意：如果细胞在室温下运行时间较长，可在室温下孵育细胞培养板1-2小时（建议培养时间不超过2小时。）

5.用HHBS或所需缓冲液制备复合板。

6.通过监测Ex / Em = 490 / 525nm处的荧光强度来进行钙通量测定。注意：在实验之前运行信号测试很重要。不同的仪器有自己的强度范围。将信号测试强度调整到大强度计数的10％至15％的水平。例如，FLIPR-384的大荧光强度计数为65,000，因此应调整仪器设置以使其信号测试强度在7,000到10,000左右。

 

数据分析

        从空白标准孔获得的读数（RFU（Max-Min））用作阴性对照。 从其他标准的读数中减去该值，以获得基线校正值。 然后，绘制标准读数以获得标准曲线和方程。 该等式可用于计算卡巴胆碱剂量样品。 

图1.使用Screen Quest Fluo-8 NW Assay Kit和Fluo-4 NW Assay Kit在HEK-293细胞中测量Carbachol剂量反应。 将HEK-293细胞以40,000个细胞/100μL/孔接种在Costar黑壁/透明底96孔板中过夜。 除去生长培养基，使用Screen Quest Fluo 8-NW钙测定试剂盒或Fluo-4 NW试剂盒（根据制造商的说明书）将细胞与100μL染料上样溶液一起在室温下孵育1小时 温度。 通过NOVOstar（BMG Labtech）添加卡巴胆碱（25μL/孔）以达到指示的浓度。 Fluo8 NW的EC50约为1.2μM。

 

参考文献

2-OMe-lysophosphatidylcholine analogues are GPR119 ligands and activate insulin secretion from βTC-3 pancreatic cells: Evaluation of structure-dependent biological activity
Authors: Anna Drzazga, Agata Sowińska, Agnieszka Krzemińska, Andrzej Okruszek, Piotr Paneth, Maria Koziolkiewicz, Edyta Gendaszewska-Darmach
Journal: Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids (2017)

A new electro-optical approach for conductance measurement: an assay for the study of drugs acting on ligand-gated ion channels
Authors: A Menegon, S Pitassi, N Mazzocchi, L Redaelli, R Rizzetto, JF Rolland, C Poli, M Imberti, A Lanati, F Grohovaz
Journal: Scientific Reports (2017)

Altered spontaneous calcium signaling of in situ chondrocytes in human osteoarthritic cartilage
Authors: Xiaoyuan Gong, Wenbin Xie, Bin Wang, Lingchuan Gu, Fuyou Wang, Xiang Ren, Cheng Chen, Liu Yang
Journal: Scientific reports (2017): 17093

Analysis of Ca2+ response of osteocyte network by three-dimensional time-lapse imaging in living bone
Authors: Tomoyo Tanaka, Mitsuhiro Hoshijima, Junko Sunaga, Takashi Nishida, Mana Hashimoto, Naoya Odagaki, Ryuta Osumi, Taiji Aadachi, Hiroshi Kamioka
Journal: Journal of Bone and Mineral Metabolism (2017): 1--10

Aryl-and alkyl-phosphorus-containing flame retardants induced mitochondrial impairment and cell death in Chinese hamster ovary (CHO-k1) cells
Authors: Chao Huang, Na Li, Shengwu Yuan, Xiaoya Ji, Mei Ma, Kaifeng Rao, Zijian Wang
Journal: Environmental Pollution (2017): 775--786

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Authors: Masaaki Ishii, Bärbel Rohrer
Journal: Cell Death Discovery (2017): 16071

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Authors: Nagendra Babu Thillaiappan, Alap P Chavda, Stephen C Tovey, David L Prole, Colin W Taylor
Journal: Nature Communications (2017): 1505

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Journal: (2017): 13--16

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Journal: Bone (2017)

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Authors: ZhongJie Liu, ChangQing Ma, Wei Zhao, QingGuo Zhang, Rui Xu, HongFei Zhang, HongYi Lei, ShiYuan Xu
Journal: Neurochemical Research (2017): 1--14

 

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