Cell Meter Caspase 3/7活性细胞凋亡检测

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荧光酶标仪
Ex:	360 nm
Em：	470 nm
Cutoff：	420 nm
推荐孔板:	黑色透明底板
读取模式:	顶/底读模式

样品实验方案

简要概述

1. 用测试化合物制备细胞（100 µL /孔/ 96孔板或25 µL /孔/ 384孔板）
2. 加入等体积的Caspase 3/7底物工作溶液
3. 在室温下孵育1小时
4. 检测Ex / Em = 350/450 nm（截止= 420 nm）的荧光强度

 

溶液配制

工作溶液配制

将50 µL Caspase 3/7底物（组分A）添加到10 mL的测定缓冲液（组分B）中，并充分混合以制成Caspase 3/7底物工作溶液。 注意：将未使用的组分A和B分装并存储在-20℃下。 避免重复冻结/解冻循环。

 

实验步骤

1. 通过向PBS或所需的缓冲液中加入10 µL /孔的10X测试化合物（96孔板）或5 µL /孔的5X测试化合物（384孔板）来处理细胞。对于空白孔（不含细胞的培养基），添加相同量的化合物缓冲液。
2. 将细胞板在37°C，5％CO₂培养箱中孵育（对于喜树碱处理过的Jurkat细胞，需要4-6小时）以诱导凋亡。
3. 加入100 µL /孔（96孔板）或25 µL /孔（384孔板）的Caspase 3/7底物工作溶液。
4. 在避光的条件下，在室温下孵育平板至少1小时。注意：如果需要，在室温下添加Caspase 3/7工作溶液之前10分钟，向选定样品中添加1 µL 1 mM Ac-DEVD-CHO caspase 3/7抑制剂，以确认对caspase 3 / 7-like的抑制活动。
5. 以800 rpm的速度离心细胞板（特别是非粘附细胞）2分钟（制动）。
6. 使用荧光酶标仪在Ex / Em = 350/450 nm（截止= 420 nm）处检测荧光强度。

 

图示

 

图1.使用Cell Meter Caspase 3/7活性凋亡测定试剂盒检测Jurkat细胞中的Caspase 3/7活性。 当天，将Jurkat细胞以80,000个细胞/孔/ 90 µL的浓度接种在Costar黑色96孔板中。 在有和没有1 µM星形孢菌素的情况下将细胞处理4小时，并在有或没有10 µM的胱天蛋白酶抑制剂AC-DEVD-CHO的情况下处理细胞10分钟。 加入半胱天冬酶3/7测定溶液（100μL/孔），并在室温下孵育1小时。 在Ex / Em ＝ 360 / 470nm（截止＝ 420nm）下测量荧光强度。

图2.白蛋白暴露上调了足细胞中的促凋亡途径。 A，活化的半胱天冬酶3/7活性相对于用5mg / ml白蛋白（实心柱）或5mg / ml右旋糖酐（实心柱）处理的足细胞中的总细胞蛋白标准化了指定的时间。 *表示与相应的右旋糖酐处理的对照相比，P <0.0001。 B，用5mg / ml葡聚糖（Dex）或5mg / ml白蛋白（Alb）处理培养的足细胞的TUNEL染色。核用DAPI染成蓝色。 TUNEL阳性细胞核是绿色的。 C，将半胱天冬酶3/7活性标准化为用5 mg / ml白蛋白或5 mg / ml白蛋白+50 µM z-VAD（泛半胱氨酸蛋白酶抑制剂）处理的足细胞中的总细胞蛋白。 z VAD很大程度上废除了caspase活性（*，P = 0.01对白蛋白+ z VAD）。 D，用锥虫蓝测定法测定的死细胞百分比，用单独的5 mg / ml白蛋白（空心柱）或5 mg / ml白蛋白+50 µM z-VAD（实心柱）处理24小时或5 mg / ml的足细胞单独使用白蛋白（水平阴影线）或5 mg / ml白蛋白+50 µM z-VAD 48小时（垂直阴影线）。 *表示在48小时时与白蛋白+ z-VAD相比，P = 0.001。 * Caspase活性是根据制造商的指导使用Caspase 3/7活性试剂盒（AAT Bioquest，Sunnyvale，CA）确定的。资料来源：Graph from Endocytosis of Albumin by Podocytes Elicits an Inflammatory Response and Induces Apoptotic Cell Death by Kayo Okamura, et al., PLoS ONE, Jan. 2013.

 

 

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