动物模型构建|斑马鱼模型构建|斑马鱼基因编辑|单碱基编辑|斑

▍参考文献

1、斑马鱼参考基因组序列及其与人类基因组的关系

The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome

斑马鱼已成为研究脊椎动物基因功能的重要模式生物。它们的胚胎几乎完全透明，并且可以通过基因敲低或过表达来加快遗传学研究的进程，因此斑马鱼被广泛用于脊椎动物基因功能的深入研究，并逐渐应用于人类遗传疾病的研究。

然而，要有效构建人类遗传疾病的模型，了解斑马鱼基因及其结构与人类同源基因之间的对应关系至关重要。为此，我们构建了一个高质量的斑马鱼基因组序列图谱。该图谱由一套重叠的、完整测序的大插入克隆组成，并通过高分辨率、高密度的减数分裂图谱进行了排序与定位。

通过详细的自动化和人工注释，我们鉴定出超过26,000个蛋白编码基因，是目前已测序脊椎动物中已知基因数量最多的物种。与人类参考基因组的比对结果显示，大约70%的人类基因在斑马鱼中都能找到至少一个明显的同源基因。

此外，这一高质量的基因组组装还揭示了多个重要的基因组特征，例如其独特的重复序列结构、假基因数量少、第4号染色体上斑马鱼特有基因的富集现象，以及与性别决定相关的染色体区域。

2、携带提前终止密码子（PTC）的mRNA通过Upf3a和COMPASS复合物组分引发遗传补偿反应

PTC-bearing mRNA elicits a genetic compensation response via Upf3a and COMPASS components

遗传补偿反应（GCR）近年来被提出，用以解释基因敲除和基因敲低实验中观察到的表型差异。然而，GCR的分子机制尚不清楚。在本研究中，我们利用斑马鱼的capn3a和nid1a基因的敲低与敲除模型，发现携带提前终止密码子（PTC）的mRNA可迅速诱发一种涉及Upf3a和COMPASS复合物组分的遗传补偿反应。

我们观察到，capn3a敲低胚胎表现出肝脏发育不良，nid1a敲低胚胎则表现出体长缩短，但相应的基因敲除突变体却表现正常。这一差异被归因于同一家族中其他基因的上调表达。

通过设计六种转基因模型，我们进一步证实，GCR的激活不仅依赖于PTC的存在，还依赖于转基因mRNA序列，及其与内源性补偿基因的同源性。研究还发现，无义介导的mRNA降解通路中的Upf3a，以及COMPASS复合物中的关键成分如Wdr5，在GCR中发挥重要作用。

此外，我们还发现，GCR的发生伴随着补偿性基因转录起始位点区域组蛋白H3第4位赖氨酸三甲基化（H3K4me3）水平的上调。

这些发现为GCR提供了可能的分子机制基础，并有望为治疗与错义突变相关的遗传疾病提供新策略——通过在突变基因中引入PTC，或引入含有PTC的转基因，来激活GCR以达到治疗的目的。

3、斑马鱼全基因组编辑中不依赖序列环境的TadA衍生胞嘧啶碱基编辑器

Sequence Context-Agnostic TadA-Derived Cytosine Base Editors for Genome-Wide Editing in Zebrafish

单核苷酸变异（SNVs）是与多种疾病密切相关的重要遗传变异形式。CRISPR介导的碱基编辑技术已成为研究SNV致病机制的重要工具，尤其适用于斑马鱼这一理想的疾病模型和药物筛选平台。然而，目前应用于斑马鱼的胞嘧啶碱基编辑器（CBEs）普遍存在编辑窗口宽泛、序列依赖性强等问题，限制了其应用效果。

在本研究中，我们通过在TadA8e酶中引入关键突变，开发出一系列斑马鱼专用的TadA衍生胞嘧啶碱基编辑器，命名为zTadA-CBEs。这些新型编辑器在编辑效率和精度方面均显著提升。其中，zTadA-BE4max与zTadA-BEmv提供了互补的编辑窗口，而zTadA-SpRY-BE4max则实现了对PAM序列更为灵活的编辑能力。

我们借助zTadA-CBEs成功建立了一个精准的Axenfeld-Rieger综合征模型，并构建了两个Hermansky-Pudlak综合征的新模型。同时，还建立了一个新型白化病模型，其F0代个体携带两个致病SNVs。

在功能恢复实验中，我们设计了特异性sgRNA，将fmsts±错义突变由T纠正为野生型的C，有效恢复了巨噬细胞数量至正常水平。

研究结果表明，zTadA-CBEs显著提高了基因组编辑的能力，并为开发SNV相关疾病的治疗策略提供了有力支持。