酶切法建库试剂盒V3

Hieff NGS^® OnePot Pro DNA Library Prep Kit V3 是一款可用于Illumina^®和MGI^®高通量测序平台的新一代酶切法建库试剂盒。与传统的建库法比较，本品采用高质量的片段化酶，摆脱了繁琐的超声过程。将片段化模块与末端修复模块合二为一，极大的降低了建库的时间和成本、连接模块的酶和buffer预混，简化了操作流程，极大地降低了建库的时间和成本，更加适合于自动化建库。本试剂盒具有更高的文库转化率，可应用于常规动植物基因组、微生物基因组等样本，同时能兼容FFPE DNA样本的建库。在前一代建库试剂盒的基础上，改进了片段化/末修/加A模块，降低了试剂对样本的GC偏好性，提高了末修和加dA尾的效率，提高了试剂的稳定性；本试剂盒使用了优化的连接酶，改善了接头连接效率。同时，本试剂盒可搭配Illumina^®或MGI^®的接头和Primer，用于Illumina^®和MGI^®高通量测序平台测序。  

       适用1ng - 1μg的基因组DNA、全长cDNA等样本

       高质量片段化酶，可随机切割双链DNA，酶切片段偏好性低

       片段化、末端修复/加A一步完成

       强扩增效率的高保真酶，显著提高文库质量及产量

       适用于FFPE DNA样本

      严格的批次性能与稳定性质控

 

产品信息

 

组分信息

注：本试剂盒组分兼容Illumina和MGI双平台，如果适配完整接头，需要额外配置专属于Illumina^®或者MGI^®的primer mix(Cat#12190 Hieff NGS^® DNA Library Prep Primer Mix for Illumina^®或Cat#12191 Hieff NGS^® DNA Library Prep Primer Mix for MGI^®)。

 

储存条件

-25~-15℃保存，有效期1年。

 

注意事项

一、关于操作

1. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

2. 请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀，短暂离心后置于冰上待用。

3. 配制各步骤反应液时推荐使用移液器吹打混匀或轻轻振荡，剧烈振荡可能会造成文库产出下降。

4. 为避免样品交叉污染，推荐使用带滤芯的枪头，吸取不同样品时请更换枪头。

5. 推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应，使用前应预热PCR仪至反应温度附近

6. PCR产物因操作不当极容易产生气溶胶污染，进而影响实验结果准确性。推荐将PCR反应体系配制区和PCR产物纯化检测区进行强制性的物理隔离；使用专用的移液器等设备；并定时对各实验区域进行清洁（使用0.5%naclo或10%漂白剂进行擦拭清理），以保证实验环境的洁净度。

7. 本产品仅作科研用途！

二、关于DNA片段化

1. 本试剂盒兼容范围为1 ng ~ 1μg Input DNA。应尽可能使用A260/A280 = 1.8-2.0的高质量Input DNA。

2. 若Input DNA中引入高浓度金属离子螯合剂或其他盐，可能会影响后续实验，建议将DNA稀释在ddH2O中进行片段化。

3. 对于常规的高质量基因组DNA，酶切时间参考表5，本试剂盒片段化偏好性低，耐受各种GC含量的模板。以上为推荐时间，需客户在自己的实验体系中进行微调，以达到最佳效果。

4. 为保证优质精确的片段化效果，片段化反应配制过程请于冰上操作。

三、关于接头连接 (Adapter Ligation)

1. 针对Illumina^®测序平台，Yeasen可提供如下接头：

a. Hieff NGS^® Complete Adapter Kit for Illumina^®, Set 1~Set 2 (Cat#13519~Cat#13520)，试剂盒中的接头浓度为15 μM；

b. Hieff NGS^® 384 CDI Primer for Illumina^®(Cat#12412~Cat#12413)，试剂盒中的接头浓度为15 μM；

c. Hieff NGS^® Stubby UDI Primer Kit for Illumina^®_，Set1~Set4（板式） (Cat#12312~Cat#12315)，试剂盒中的接头浓度为15 μM；

d. Hieff NGS^® Dual UMI UDI Adapter Kit for Illumina^®，Set1~Set2 （Cat#13370~Cat#13371），试剂盒中的接头浓度为15 μM。

2.针对MGI^® 高通量测序平台，Yeasen可提供如下接头：

a. Hieff NGS^® Complete Adapter Kit for MGI^®，Set 1~Set 3（Cat#13360 ~ Cat#13362），试剂盒中的接头浓度为10 μM；

b. Hieff NGS^® Unique Dual Barcode Primer Kit for MGI®，Set 1~Set 4（板式） （Cat#13536 ~ Cat#13539），试剂盒中的接头浓度为10 μM；

c. Hieff NGS^® Dual UMI UDB Adapter Kit for MGI^®，Set 1~Set 2 (Cat#13367~Cat#13368)双端UMI UDB短接头，试剂盒中的接头浓度为10 μM。

3. Adapter的质量和使用浓度直接影响连接效率及文库产量。Adapter用量过高可能会产生较多Adapter Dimer；用量较低可能会影响连接效率及文库产量；使用Adapter时根据Input DNA量用TE Buffer进行相应稀释。 

表1和表2分别列举了使用本试剂盒的不同Input DNA量推荐的针对Illumina^® or MGI^®测序平台常规和UMI Adapter的稀释方法。

表1  1ng~1 μg Input DNA针对Illumina^®测序平台推荐常规和UMI Adapter使用浓度

表2  1ng~1μg Input DNA针对MGI^®测序平台推荐常规和UMI Adapter使用浓度

 

四、关于磁珠纯化与分选 (Bead-based Clean Up and Size Selection)

1. DNA片段长度分选步骤可选择在末端修复/dA尾添加之前，或接头连接后，或文库扩增后进行。

2. 当Input DNA质量≥50 ng，您可选择在接头连接后分选；如Input DNA质量小于50 ng，建议您在文库扩增后进行分选。

3. Ligation Enhancer中包含高浓度的PEG，会对双轮分选产生显著影响。因此，如在接头连接后进行长度分选，必须先进行纯化步骤，再进行双轮分选步骤；如在末端修复/dA尾添加之前或文库扩增后进行长度分选，可直接进行双轮磁珠分选步骤。

4. 磁珠使用前应先平衡至室温，否则会导致得率下降、分选效果不佳。

5. 磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。

6. 转移上清时，请勿吸取磁珠，即使微量残留都将影响后续文库质量。

7. 磁珠漂洗使用的80%乙醇应现用现配，否则将影响回收效率。

8. 进行长度分选时，初始样品体积应尽量≥100 μL，不足时请用超纯水补齐。以防因样品体积太小导致移液误差增大。

9. 产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应；过分干燥又会导致磁珠开裂进而降低纯化得率。通常情况下，室温干燥3~5 min足以让磁珠充分干燥。

10. DNA纯化或长度分选产物如需保存，可使用TE Buffer洗脱，产物可于4℃可保存1~2周，-20℃可保存1个月。

 

五、关于文库扩增 (Library Amplification)

文库扩增步骤需要严格控制扩增循环数。循环数不足，将导致文库产量低；循环数过多，又将导致文库偏好性增加、重复度增加、嵌合产物增加、扩增突变积累等多种不良后果。表3列举了使用本试剂盒，获得1μg文库的推荐循环数。

表3  100 pg~1 μg Input DNA获得1 μg产物扩增循环数推荐表

【注】如果使用了不完整的接头，需要扩增1~3个循环，形成完整的接头。建库过程中若进行片段分选，扩增时请参照较高循环数扩增。

 

六、关于文库质检 (Library Quality Analysis)

1. 通常情况下，构建好的文库可通过长度分布检测和浓度检测来进行质量评价。

2. 文库浓度检测可使用：基于双链DNA荧光染料的方法，如Qubit^®、PicoGreen^®等；基于qPCR绝对定量的方法。

3. 文库浓度检测不可使用：基于光谱检测的方法，如NanoDrop^®等。

4. 推荐使用qPCR方法进行文库浓度检测：Qubit^®、PicoGreen^®等基于双链DNA荧光染料的浓度测定方法时，无法有效区分单端连接Adapter的产物、两端均未连接Adapter的产物以及其他不完整双链结构产物；qPCR绝对定量基于PCR扩增原理，仅定量样品中两端Adapter完整的文库（即可测序的文库），可排除单端或双端都不连接Adapter的不可测序文库干扰。

5. 文库长度分布检测，可通过Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛细管电泳或微控流原理的设备进行检测。

 

使用说明

一、自备材料

1. 纯化磁珠：Cat#12601，Hieff NGS^® DNA Selection Beads或Cat#A63880，AMPure XP Beads或其他等效产品。

2. DNA质控：Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer或其他等效产品。

3. DNA Adapter：接头详细介绍信息参考上面注意事项中的第三部分“关于接头连接”。

1. DNA Primer Mix：Cat#12190，DNA Library Prep Primer Mix for Illumina^® 或Cat#12191，DNA Library Prep Primer Mix for MGI^®
2. 其他材料：无水乙醇、灭菌超纯水、TE Buffer (10 mM Tris-HCl，pH 8.0-8.5+1 mM EDTA)、低吸附EP管、PCR管、磁力架、PCR仪等。

二、操作流程

图1 OnePot Pro DNA建库试剂盒操作流程

三、操作步骤

3.1 DNA片段化/末端修复/dA尾添加 (DNA Fragmentation/End Repair/dA-Tailing)

该步骤将基因组DNA片段化，同时进行末端修复及dA尾添加。

1. 将表4中各试剂解冻后，颠倒混匀，置于冰上备用。

2. 于冰上配制表4反应体系。

表4  DNA片段化/末端修复/dA尾添加 PCR反应体系

3. 使用移液器轻轻吹打或低速振荡混匀，并短暂离心将反应液离心至管底。

4. 将上述PCR管置于PCR仪，设置表5所示反应程序，进行DNA片段化，末端修复及dA尾添加反应。

表5  DNA片段化/末端修复/dA尾添加 PCR反应程序

【注】：*DNA片段化过程为有效控制片段化效果，避免过度酶切，反应程序可预先设置4℃，待模块温度降至4℃时，将PCR管放入PCR仪。

**对于完整的基因组DNA，酶切时间参考表6。

表6  常规基因组DNA片段化条件选择表

                    

不同打断条件下片段大小分布图可见“实施例”部分的图2~图4.

3.2 接头连接 (Adapter Ligation)

该步骤将3.1步骤的产物末端，连接Illumina^®或MGI^®接头。

1. 根据Input DNA量按第三部分推荐的接头使用浓度，稀释Adapter至合适浓度。

2. 将表7中各试剂解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。

3. 于3.1步骤PCR管中配制表7所示反应体系。

表7  Adapter Ligation PCR体系

【注】：*LigationReady Mix比较粘稠，请上下颠倒、振荡，充分混匀并瞬时离心后使用。

**本公司接头浓度与常规商业化试剂盒一致，Illumina^®平台皆为15 μM，MGI^®平台皆为10 μM；具体的接头使用量可以参照表1。

1. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。
2. 将PCR管置于PCR仪中，设置表8所示反应程序，进行接头连接反应。

表8  Adapter Ligation PCR反应程序

【注】：当Input DNA量较低，实验效果不理想时，可尝试将连接时间延长一倍。

3.3 连接产物磁珠纯化 (Post Ligation Clean Up)

3.3.1纯化操作步骤

该步骤使用磁珠对3.2步骤的产物进行纯化或分选。纯化可除去未连接的Adapter或Adapter Dimer等无效产物。

1. 准备工作：将Hieff NGS^® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

3. 将Adapter Ligation产物充分离心，然后吸取72 μL Hieff NGS^® DNA Selection Beads (0.8×，Beads:DNA=0.8:1)至Adapter Ligation产物中，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温孵育5 min。

4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约5 min），小心移除上清；待移除大部分上清后可短暂离心再次置于磁力架中，换用10 μL的枪头彻底吸净残留液体。

5. 保持PCR管始终置于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec后，小心移除上清。

6. 重复步骤5，总计漂洗两次，最后一次漂洗结束，要彻底吸净乙醇。

7. 保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过5 min）。

8. 将PCR管从磁力架中取出：

1）若产物无需分选则直接加入21 μL ddH₂O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5 min。置于磁力架上，待溶液澄清后，小心移取20 μL上清至新的PCR管中，切勿触碰磁珠。

2）若产物需进行双轮分选，则加入102μL ddH₂O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5 min。置于磁力架上，待溶液澄清后，小心移取100 μL上清至新的PCR管中，切勿触碰磁珠。

3.3.2双轮分选操作步骤

1. 准备工作：将Hieff NGS^® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

3.根据DNA片段长度要求，参考表9向上述100ul连接产物上清中加入第一轮分选磁珠，涡旋振荡或充分颠倒磁珠混匀。

表9  磁珠文库分选推荐比例

【注】：表中“×”表示上步骤连接产物体积。如文库插入片段长度为250 bp，连接产物体积为100 μL，则第一轮分选磁珠使用体积为0.70×100 μL=70 μL；第二轮分选磁珠使用体积为0.20×100 μL=20 μL；表中所推荐比例是针对于Adapter Ligated Insert DNA (Post Ligation)，如果用户在接头连接前进行分选，请采用Hieff NGS^® DNA Selection Beads (Cat#12601)说明书中推荐的比例。

4. 室温孵育5 min。

5. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中，待溶液澄清后（约5 min），小心转移上清到干净的离心管中。

6. 参考表9向上清中加入第二轮分选磁珠。

7. 涡旋混匀或移液器吹打10次混匀，室温静置5 min。

8. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中，待溶液澄清后（约5 min），小心移除上清。

9. 保持PCR管始终处于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec，小心移除上清。

10. 重复步骤9，总计漂洗两次，最后一次漂洗结束，要彻底吸净乙醇。

11. 保持PCR管始终处于磁力架中，开盖干燥磁珠至刚刚出现龟裂（约5 min）。

12. 将PCR管从磁力架中取出，加入适量21 μL ddH2O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀，室温静置5 min。

13. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体。待溶液澄清后（约5 min），小心转移20 μL上清至干净的管中。

 

3.4 文库扩增 (Library Amplification)

该步骤将对纯化或长度分选后的接头连接产物进行PCR扩增富集。

1. 将表10中试剂解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。

2. 于无菌PCR管中配制表10所示反应体系。

表10  PCR扩增反应体系

【注】：*Primer Mix针对不同测序平台，选用与平台对应的Adapter和Primer Mix。

**如果使用的是完整接头（Cat#13519~Cat#13520），使用DNA Library Prep Primer Mix for Illumina（Cat#12190）试剂盒中的Primer Mix进行扩增；如果使用的是MGI接头（Cat#13360 ~ Cat#13362），使用DNA Library Prep Primer Mix for MGI（Cat#12191）试剂盒中的Primer Mix进行扩增；如果使用了不完整的接头（Cat#12412~Cat#12413、Cat#12404~Cat#12407），请参照上述试剂盒说明书，使用其中配备的Index Primer进行扩增。

3. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。

4. 将PCR管置于PCR仪中，设置表11所示反应程序，进行PCR扩增。

表11  PCR扩增反应程序

3.5扩增产物磁珠纯化或分选 (Post Amplification Clean Up/Size Selection)

扩增后纯化步骤同3.3.1纯化操作步骤。使用Hieff NGS^® DNA Selection Beads (1.0×，Beads:DNA=1:1)纯化文库扩增产物。如需分选，操作方法同3.3.2双轮分选步骤。

3.6 文库质量控制(Library Quality Analysis)

通常情况下，构建好的文库可通过浓度检测和长度分布检测来进行质量评价，具体请参见注意事项六。

四、实验实例

不同片段化条件得到的插入片段大小

以500 ng 常规gDNA为模板，使用本试剂盒构建文库，片段化条件为32℃/35℃/37℃分别酶切5/10/ 15/20/30 min，片段化产物1.2x磁珠纯化，21 μL ddH₂O洗脱，Qubit测定浓度后，回收的插入片段分布如下图所示。

图2 32℃不同酶切时间文库峰图

 

图3 35℃不同酶切时间文库峰图

 

 

图4 37℃不同酶切时间文库峰图