Target Engagement (TE) assay实验

Target Engagement (TE) assay实验服务：在活细胞内研究化合物与靶蛋白相互作用

1.工作原理

NanoBRET™ Target Engagement Assays 是一种在活细胞内研究蛋白：小分子化合物相互作用的检测系统，应用能量共振转移技术检测分子间的结合。如下图所示，NanoBRET® Target Engagement (TE) Assay 技术使用 NanoLuc® 萤光素酶作为能量供体，带有荧光基团  618 的示踪剂-NanoBRET™ tracer (能量受体)可以透过细胞膜，进入细胞与 NanoLuc®- 靶点融合蛋白相互作用产生 BRET 信号，而待测化合物与靶蛋白的亲和力通过其与 NanoBRET™ tracer 的竞争性置换来检测，NanoBRET™ tracer 在细胞中与 NanoLuc®萤光素酶融合表达的靶蛋白是可逆性结合的。当待测化合物与靶点蛋白存在相互作用时，会与 tracer 竞争结合，从而引发  BRET 信号减弱。可用于在活细胞内研究蛋白：小分子化合物的亲和力及药物的透膜性，同时也可检测化合物在活细胞中的滞留时间。该技术是基于大幅度改良的 (Bioluminescence Resonance Energy Transfer，生物发光共振能量转移) 分析平台，可用于在活细胞内研究化合物与靶蛋白相互作用。

2.技术特点

1.背景信号低：

来自 NanoLuc® 供体的明亮的蓝移发光信号耦合到远红移的荧光基团上，光谱叠加更佳、信号更强、且与传统 BRET 分析相比背景信号更低。

2. 检测亲和力：

可以量化细胞内化合物的亲和力或表观 Ki，以及部分占有率，以实现对相似目标的精确选择性测量。

3.渗透性评估：

通过比较活细胞模式和渗透细胞模式的结果，评估化合物在细胞内的渗透性。

4.滞留时间评估及抑制剂筛选：

可测量活细胞中化合物的滞留时间，也可用于抑制剂筛选，比较不同化合物的 IC50值。

3.技术的应用及优点

同时，NanoLuc 萤光素酶的分子量仅为 19.1kDa，远小于萤火虫 (Photinus pyralis) 和海肾 (Renilla reniformis) 萤光素酶的分子量，体积小，更适合于融合蛋白表达构建和 BRET 检测，并且表达效率高，光信号更强，非特异性自发光背景更低。

4.检测的操作流程

4.1►亲和力和选择性检测

分析受测化合物的 target engagement，使用固定浓度的 NanoBRET™ Tracer 处理细胞，该浓度接近 NanoBRET™ Tracer 量效曲线的 EC50 值。为了确定受测化合物的亲和力在固定浓度的  NanoBRET™ Tracer (通常是  EC50-EC80) 存在下，以不同浓度受测化合物处理细胞，检测 BRET 信号，根据图像得到解离常数 Kd 值 (示意图及过程如下)。

(1) 检测过程：

(2) 检测示意图：

(3) 结果展示

4.2►滞留时间检测

滞留时间分析是通过示踪剂 Tracer  竞争引起的化合物离解动力学分析来测定。将细胞与接近饱和剂量的受试化合物（例如IC80）孵育，该化合物能够与目标 NanoLuc® 融合蛋白结合。去除未结合的受试化合物，然后加入 NanoBRET™ Tracer 和检测试剂。通过对 NanoBRET™ 信号的动力学检测评估化合物的滞留时间。在加入示踪剂 Tracer 后，加入滞留时间短的化合物将导致 BRET 信号的快速增加，共价结合/不可逆结合或长滞留时间的化合物的 BRET 信号将随时间缓慢/逐渐增加。

(1) 检测过程：

 

(2) 检测示意图：

(3) 结果展示

5.主要应用

192 种激酶检测：

BET BRD 靶点相关药物检测

HDAC 靶点相关药物检测

E3 Ligases 靶点相关药物检测

NLRP3 靶点相关药物检测

PARP 靶点相关药物检测

RAS 靶点相关药物检测

RAF 靶点相关药物检测

GPCRs 靶点相关药物检测

Heat Shock Protein (HSP) 靶点相关药物检测

6.应用案例

(1)瞬时转染表达有 HDAC1-NanoLuc® 全长融合蛋白的 HeLa 细胞的滞留时间分析

(2) PARP 靶点相关药物检测

(3) NLRP3 靶点相关药物检测

(4) BET BRD 靶点相关药物检测