- ￥800
- LSM Bio
- 进口
- PVT0344
- 2025年07月15日
企业认证
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 保存条件：
负20摄氏度
- 保质期：
3个月
- 英文名：
pET-30b
- 库存：
100
- 供应商：
LSMBIO
- 规格：
2ug
pET-30b
Search name
pET-30b,Plasmid pET-30b,pET-30b vector
pET-30b Description
pET-30b Sequence
LOCUS Exported 5421 bp ds-DNA circular SYN 05-8-2015
DEFINITION synthetic circular DNA
ACCESSION .
VERSION .
KEYWORDS Untitled 4
SOURCE synthetic DNA construct
ORGANISM synthetic DNA construct
REFERENCE 1 (bases 1 to 5421)
AUTHORS .
TITLE Direct Submission
JOURNAL Exported 2015-8-5
FEATURES Location/Qualifiers
source 1..5421
/organism="synthetic DNA construct"
/mol_type="other DNA"
source 354..376
/organism="Enterobacteria phage T7"
/mol_type="genomic DNA"
/db_xref="taxon:10760"
terminator 26..73
/note="T7 terminator"
/note="transcription terminator for bacteriophage T7 RNA
polymerase"
CDS complement(140..157)
/codon_start=1
/product="6xHis affinity tag"
/note="6xHis"
/translation="HHHHHH"
CDS complement(218..232)
/codon_start=1
/product="enterokinase recognition and cleavage site"
/note="enterokinase site"
/translation="DDDDK"
CDS complement(248..292)
/codon_start=1
/product="affinity and epitope tag derived from pancreatic
ribonuclease A"
/note="S-Tag"
/translation="KETAAAKFERQHMDS"
CDS complement(299..316)
/codon_start=1
/product="thrombin recognition and cleavage site"
/note="thrombin site"
/translation="LVPRGS"
CDS complement(326..343)
/codon_start=1
/product="6xHis affinity tag"
/note="6xHis"
/translation="HHHHHH"
RBS 354..376
/note="efficient ribosome binding site from bacteriophage
T7 gene 10 (Olins and Rangwala, 1989)"
protein_bind 391..415
/bound_moiety="lac repressor encoded by lacI"
/note="lac operator"
/note="The lac repressor binds to the lac operator to
inhibit transcription in E. coli. This inhibition can be
relieved by adding lactose or
isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)."
promoter complement(416..434)
/note="T7 promoter"
/note="promoter for bacteriophage T7 RNA polymerase"
promoter 747..824
/gene="lacI"
/note="lacI promoter"
CDS 825..1907
/codon_start=1
/gene="lacI"
/product="lac repressor"
/note="lacI"
/note="The lac repressor binds to the lac operator to
inhibit transcription in E. coli. This inhibition can be
relieved by adding lactose or
isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)."
/translation="MKPVTLYDVAEYAGVSYQTVSRVVNQASHVSAKTREKVEAAMAEL
NYIPNRVAQQLAGKQSLLIGVATSSLALHAPSQIVAAIKSRADQLGASVVVSMVERSGV
EACKAAVHNLLAQRVSGLIINYPLDDQDAIAVEAACTNVPALFLDVSDQTPINSIIFSH
EDGTRLGVEHLVALGHQQIALLAGPLSSVSARLRLAGWHKYLTRNQIQPIAEREGDWSA
MSGFQQTMQMLNEGIVPTAMLVANDQMALGAMRAITESGLRVGADISVVGYDDTEDSSC
YIPPLTTIKQDFRLLGQTSVDRLLQLSQGQAVKGNQLLPVSLVKRKTTLAPNTQTASPR
ALADSLMQLARQVSRLESGQ"
CDS 2716..2907
/codon_start=1
/gene="rop"
/product="Rop protein, which maintains plasmids at low copy
number"
/note="rop"
/translation="MTKQEKTALNMARFIRSQTLTLLEKLNELDADEQADICESLHDHA
DELYRSCLARFGDDGENL"
misc_feature 3009..3151
/note="bom"
/note="basis of mobility region from pBR322"
rep_origin complement(3337..3925)
/direction=LEFT
/note="ori"
/note="high-copy-number ColE1/pMB1/pBR322/pUC origin of
replication"
CDS 4047..4862
/codon_start=1
/product="aminoglycoside phosphotransferase"
/note="KanR"
/note="confers resistance to kanamycin in bacteria or G418
(Geneticin(R)) in eukaryotes"
/translation="MSHIQRETSCSRPRLNSNMDADLYGYKWARDNVGQSGATIYRLYG
KPDAPELFLKHGKGSVANDVTDEMVRLNWLTEFMPLPTIKHFIRTPDDAWLLTTAIPGK
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文献和实验真DNA聚合酶可能会导致此问题。大肠杆菌 BL21（DE3）中的蛋白质表达重组pET-32α（+）载体可以表达所需的蛋白质，其在被异丙基β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导后与大肠杆菌 BL21（DE3）中的109aa Trx•Tag TM融合。首先，将含有100μg/ ml氨苄青霉素的10ml LB培养基与含有重组pET-32α（+）载体的新鲜细菌菌落一起接种37℃过夜; 然后，将500-μl过夜培养物加入到含有100-μg/ ml氨苄青霉素的30-ml新鲜LB培养基中，在37℃接种直至OD 600
了。这次用的是100 ug/ul的Amp浓度。转接的时候是1:500稀释。（我不知道1:100行不行，一朝被蛇咬，十年怕井绳啊。在OD600达到0.8的时候诱导。 转接的时候做对照：IPTG 0 h， 同时做诱导：2 h, 3 h 主要结果有三： A 有表达； B 阴性对照也有表达 ，所以这个结果不是很convincing； C 目的蛋白应该在30 kD，但分子量显示是36 kD左右（这个问题是个低级错误，接下来的帖子会指出 ）。 原因
是positive expression control。是pET15b携带b-galactosidase的一个构建。泳道1－8是全细胞蛋白电泳；泳道9－12是取沉淀电泳；13－16是上清电泳。结果：a. 有glucose的阴性对照无带（或非常浅）。b. 无glucose的阴性对照有带，但整体来说比诱导的弱。c. 诱导的有带。d. 蛋白大小还是不对（其实是对的，我冤枉它了，请看后面的帖子）。结论：培养基中确实很可能存在lactose。而且应该是造成阴性对照有表达的原因。 现在头疼的就是分子量的问题
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