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- 2025年07月16日
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免疫荧光四标五色（双宽玻片）
服务介绍：
免疫荧光四标即利用酪胺信号放大（TSA，Tyramide signal amplification）即TSA技术，在同一张切片上对四种蛋白同时进行标记，从而可实现对多种蛋白空间定位，定性及半定量分析。
TSA技术主要原理为荧光标记的酪胺在二抗上偶联的HRP与H2O2的作用下变为活化的酪胺并附着在靶标周围的蛋白酪-氨酸残基上，此结合是共价结合。而一抗与靶标、二抗与一抗之间是非共价结合。通过抗体洗脱液处理，非共价结合的一抗二抗被洗脱掉，而共价结合的荧光酪胺依然附着在靶标周围，将靶标通过荧光标记显示出来。在检测第二个靶标时，相当于全新的一轮标记，无需考虑第二轮的抗体是否与第一轮的抗体产生交叉反应。只需改变不同种类荧光染料标记TSA即可实现多个靶标的标记。通过多次重复免疫标记，使用不同的荧光酪胺实现双重或多重荧光染色。
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名称 |
规格 |
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免疫荧光四标五色（双宽玻片） |
张 |
送样运输要求：
1、石蜡切片常温保存运输，冰冻切片﹣20℃保存运输
2、细胞爬片PFA固定15min后用无菌PBS洗涤，无菌PBS浸泡，4℃冰袋保存运输到实验室
实验大体流程：
石蜡切片脱蜡至水——微波抗原修复——画圈双-氧水封闭——血清封闭——孵育第一种一抗
——孵育HRP二抗——孵育iF440-TSA——抗体洗脱——血清封闭——孵育第二种一抗
——孵育HRP二抗——孵育iF488-TSA——抗体洗脱——血清封闭——孵育第三种一抗
——孵育HRP二抗——孵育iF555-TSA——抗体洗脱——血清封闭——孵育第四种一抗
——孵育HRP二抗——孵育iF647-TSA——DAPI染核——自发荧光淬灭——抗荧光淬灭封片剂封片——扫描全景成像。
（TSA荧光染料的搭配及加样顺序根据各抗体的表达情况来确定。）
实验具体流程：
1、石蜡切片脱蜡至水：依次将石蜡切片放入环保型脱蜡液I 10min-环保型脱蜡液II 10min-环保型脱蜡液III 10min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-无水乙醇Ⅲ 5min-蒸馏水洗。
2、抗原修复：组织切片置于盛满抗原修复缓冲液PH 6.0 柠檬酸；PH 9.0 EDTA； PH 8.0 EDTA）的抗原修复盒中于微波炉内进行抗原修复。维持缓冲液沸腾10min左右，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PH7.4 PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min(修复液种类和修复条件根据组织来确定，优先推荐 PH 6.0 柠檬酸修复液）。
3、画圈, 双-氧水封闭：切片稍甩干后用免疫组化笔在组织周围画圈（防止试剂流走），切片平放于避光湿盒滴加3%双-氧水溶液，室温避光孵育25 min左右，封闭内源性过氧化物酶。将玻片置于PH7.4 PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
4、血清封闭:切片平放于避光湿盒滴加血清室温封闭30min。一抗是山羊来源用10%兔血清封闭，一抗其它来源的用3%BSA封闭。
5、加第一种一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加用无菌PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于避光湿盒内4°C孵育过夜（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）。
6、加对应种属HRP标记二抗：将玻片置于PH7.4 PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后平放于透明湿盒在圈内滴加与一抗相应种属的HRP标记的二抗覆盖组织，室温孵育50min。
7、加iF440-TSA：将玻片置于PH7.4 PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后将切片平放于避光湿盒在圈内滴加iF440-TSA，避光室温孵育10min。 孵育完后，将玻片置于TBST中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
8、抗体洗脱：切片稍甩干后，滴加抗体洗脱液铺满整个组织，室温孵育5 min后去除抗体洗脱液，再次滴加足量的抗体洗脱液完-全覆盖组织，37°C孵育30 min，孵育完成后将玻片置于TBST中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
9、血清封闭:切片平放于避光湿盒滴加血清室温封闭30min。一抗是山羊来源用10%兔血清封闭，一抗其它来源的用3%BSA封闭。
10、加第二种一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加用无菌PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于避光湿盒内4°C孵育过夜（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）。
11、加对应种属HRP标记二抗：将玻片置于PH7.4 PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的HRP标记的二抗覆盖组织，室温孵育50min。
12、加iF488-TSA：将玻片置于PH7.4 PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后将切片平放于避光湿盒在圈内滴加iF488-TSA，避光室温孵育10min。 孵育完后，将玻片置于TBST中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
13、抗体洗脱：切片稍甩干后，滴加抗体洗脱液铺满整个组织，室温孵育5 min后去除抗体洗脱液，再次滴加足量的抗体洗脱液完-全覆盖组织，37°C孵育30 min，孵育完成后将玻片置于TBST中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
14、血清封闭:切片平放于避光湿盒滴加血清室温封闭30min。一抗是山羊来源用10%兔血清封闭，一抗其它来源的用3%BSA封闭。
15、加第三种一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加用无菌PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于避光湿盒内4°C孵育过夜（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）。
16、对应的HRP标记的二抗：将玻片置于PH7.4 PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后将切片平放于避光湿盒在圈内滴加与一抗相应种属的HRP标记的二抗覆盖组织，室温孵育50min。
17、加iF555-TSA：将玻片置于PH7.4 PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后将切片平放于避光湿盒在圈内滴加iF546-TSA，避光室温孵育10min。 孵育完后，将玻片置于TBST中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
18、抗体洗脱：切片稍甩干后，滴加抗体洗脱液铺满整个组织，室温孵育5 min后去除抗体洗脱液，再次滴加足量的抗体洗脱液完-全覆盖组织，37°C孵育30 min，孵育完成后将玻片置于TBST中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
19、血清封闭:切片平放于避光湿盒滴加血清室温封闭30min。一抗是山羊来源用10%兔血清封闭，一抗其它来源的用3%BSA封闭。
20、加第四种一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加用无菌PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于避光湿盒内4°C孵育过夜（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）。
21、对应的HRP标记的二抗：将玻片置于PH7.4 PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后将切片平放于避光湿盒在圈内滴加与一抗相应种属的HRP标记的二抗覆盖组织，室温孵育50min。
22、加iF647-TSA：将玻片置于PH7.4 PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后将切片平放于避光湿盒在圈内滴加iF647-TSA，避光室温孵育10min。 孵育完后，将玻片置于TBST中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
23、DAPI复染细胞核：切片稍甩干后将切片平放于避光湿盒在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min。将玻片置于PH7.4 PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
24、自发荧光淬灭：切片稍甩干后将切片平放于避光湿盒在圈内加入自发荧光淬灭剂5min，流水冲洗10min。
25、封片：将玻片置于PH7.4 PBS中在钟摆摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。
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文献和实验免疫荧光四标五色（双宽玻片）
免疫荧光单标记和双标记的方法 1免疫荧光单标记方法 免疫 荧光单标记是指只标记一种蛋白质分子，方法比较简单，只要按照染色步骤去做，通常不存在太多的问题。但要注意固定液的选择，固定液选择的合适与否，可能会直接影响染色结果。具体染色方法如下。 1)所需材料与试剂 (1)培养在盖玻片或玻璃培养皿中融合程度达到60％一70％的细胞。 (2)一抗、FITC或TRITC标记的二抗。 (3)4％多聚甲醛固定液或冷
：如果你将用的confocal microscope是载物台运动扫描（镜头在底下），则细胞必须是贴壁很牢的；如果是激光束运动扫描方式，则只要细胞能够沉淀在培养皿底部即可。注意培养皿底部要是很薄的玻璃片形式的。新手小猪：共聚焦显微镜可以让你清楚地看到细胞各个层面，所以有利于细胞内蛋白质以及细胞器的定位（当然，这些必须是经过标记你才能看到）。victor2002：观察普通免疫荧光（FIAT）的荧光显微镜可不可以用来观察细胞自发荧光吗？我用pEGFP质粒转染HepG2细胞，不知可不可以用观察普通免疫荧光的荧光显微镜观察？还是必须
免疫细胞化学/免疫荧光（ICC/IF）是一种使用荧光抗体或染料来检测细胞内靶抗原的技术。本实验方案详述了使用 Cytospin™ 离心对悬浮细胞进行 ICC/IF 的流程。点击下载此实验方案>>一般流程1. 用聚乙.烯亚胺或多聚赖氨酸涂覆盖玻片，在室温下放置 1 小时。2. 用无菌水充分漂洗盖玻片 3 次，每次 1 小时。3. 充分干燥盖玻片，在紫外光下灭菌至少 4 小时。4. 使细胞在玻璃盖玻片上生长，或制备 Cytospin 或涂片制备物。5. 用磷酸盐缓冲液 (PBS) 简单漂洗。推荐
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