RACE实验常见问题解答

一、RACE-PCR是什么？与反向PCR有什么区别吗?

RACE是rapid amplification of cDNA ends的缩写，是一种从低丰度转录本中快速扩增cDNA5’和3’末端的简单有效的方法。

RACE的原理是在PCR技术的基础上用已知的部分cDNA序列来获得完整cDNA 5’和3’末端的方法，为要获得cDNA 3’末端，以Oligo dT17和一个35bp的接头〔（dT）17－adaptor〕为引物反转录总RNA得到（－）cDNA。引物的接头有一个在基因组DNA中罕见的RE酶切位点，这样就在未知的cDNA末端接上了一段特殊的接头序列。然后用一个基因特异性引物（3‘amp）与少量第一条（－）cDNA链退火（一般＜1ng）并延伸，产生互补的第二条（＋）cDNA链。最后用3'amp和接头引物进行PCR扩增即可得到cDNA双链。

反向PCR是对一个已知序列的DNA片断两侧的未知序列进行扩增和研究的方法。

二、PCR引物和RACE引物有什么区别

从设计引物的技术上讲，两者没有显著区别。

但是设计引物时是根据预测的基因序列，而实际在RACE的PCR扩增中，模板是由mRNA逆转录而来的cDNA，由于预测的基因序列和实际的编码序列可能会不完全相同。所以会存在这样的可能，设计的引物是位于内含子中，这样可能就没有特异性的扩增产物。

另外，做RACE实验，一般都需要通过nested PCR来增加特异性产物，所以一般要设计两对引物。

 

三、超长片段RACE时要注意什么？

以我们的一点浅薄的经验来看，有几下几点建议：

（1）每一轮PCR都需要做个梯度找出最佳退火温度；

（2）检测RNA是否降解，只有确认没有或只有轻微降解后面的实验才有意义；

（3）用于第二轮巢式或半巢式PCR模板的第一轮产物应该以不同倍数稀释；

（4）扩增较长片段时应该适当延长变性时间；

（5）GSP引物设计也不容忽视，需要保证较好的特异性；

（6）使用LA Taq酶，并配以热启动；

 

四、5′RACE扩增的电泳结果为什么出现多种条带？

原因可能是：

（1）扩增的基因为多基因家族的成员；

（2）已知序列信息有限，导致PCR扩 增特异性差；

（3）mRNA 5′端剪切、拼接方式不同。

 

五、3′RACE PCR扩增产物经电泳分析后，有时为什么出现多条带是什么原因？

（1）未知序列信息不清楚导致了非特异性扩增；

（2）扩增的基因为多基因家族的成员；

（3）mRNA不同的拼接方式造成的。