CHIP实验

专业承接各类裸鼠、大鼠、小鼠、兔等动物模型建立以及后续检测服务，模型建立包含裸鼠皮下瘤、原位瘤、糖尿病模型、胃炎模型、急性肺损伤、肺纤维化、子宫内膜异位、白癜风、痛风、骨缺损、肝纤维化、关节炎、脓毒症、支气管哮喘、抑郁症、白血病、脑缺血再灌注、骨质疏松、酒精性肝病、学习记忆障碍、胃溃疡、急性心肌缺血、感染性休克、肝硬化等动物实验模型建立，以及后续各项检测。

  在生命科学研究领域内，进行实验研究所需要的基本条件可以总括为：实验动物、设备、信息和试剂。实验动物作为生命科学研究中的基本要素之一，在很多领域的科学研究中，充当着非常重要的安全试验、效果试验、标准试验的角色，尤其在药物有效性和安全性评价中发挥着不可或缺的作用。

  安徽乐奥贝生物技术公司可以独立开展包括大鼠、小鼠、裸鼠、豚鼠、兔等常见实验动物在内的动物造模及相关实验，现已熟练掌握近30余种不同类型动物模型的造模方法。

1. 实验原理
   • 染色质免疫沉淀（ChIP）实验是研究蛋白质与 DNA 相互作用的重要技术。其原理是在活细胞状态下，通过甲醛等交联剂将蛋白质 - DNA 复合物固定，使它们之间的相互作用得以保持。然后将细胞裂解，把染色质切割成较小的片段，一般采用超声破碎或者酶解的方法。超声破碎是利用超声波的能量将染色质打断成合适大小的片段，片段大小通常在 200 - 1000bp 左右；酶解则是使用微球菌核酸酶等酶将染色质消化成合适的片段。之后利用特异性抗体对目标蛋白质 - DNA 复合物进行免疫沉淀，将与目标蛋白结合的 DNA 片段富集出来，最后通过对富集的 DNA 片段进行分析，如 PCR 检测、测序等来确定蛋白质与 DNA 的结合位点。
2. 实验准备
   • 细胞培养
     • 根据研究目的选择合适的细胞系。例如，如果研究转录因子与特定基因启动子的相互作用，对于研究哺乳动物基因表达调控的情况，可以选择 HEK293 细胞、HeLa 细胞等。细胞要在适宜的培养基（如 DMEM 培养基、RPMI - 1640 培养基）中，在 37℃、5% CO₂的培养条件下培养至合适的密度，一般要求细胞数量足够用于后续实验，且细胞状态良好。
   • 试剂准备
     • 交联剂：甲醛是最常用的交联剂，其作用是将蛋白质与 DNA 交联在一起。使用时要注意甲醛的浓度和交联时间，一般使用 1% 的甲醛，交联时间在 10 - 30 分钟左右，交联时间过长可能会导致过多的非特异性交联，过短则可能无法有效固定蛋白质 - DNA 复合物。
     • 裂解缓冲液：用于裂解细胞，释放染色质。典型的裂解缓冲液成分包括 Tris - HCl（提供合适的 pH 环境）、NaCl（维持离子强度）、EDTA（螯合金属离子，抑制核酸酶等）、SDS（十二烷基硫酸钠，用于溶解细胞膜和核膜等）等。不同的实验方案可能会对裂解缓冲液的成分和浓度进行调整。
     • 抗体：选择特异性针对目标蛋白的抗体是实验成功的关键。抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，其质量和特异性需要通过验证，例如可以通过 Western blot 等方法检测抗体对目标蛋白的识别能力。
     • 蛋白酶抑制剂和核酸酶抑制剂：在实验过程中加入这些抑制剂可以防止蛋白质和 DNA 被降解。蛋白酶抑制剂可以抑制细胞内的蛋白酶活性，核酸酶抑制剂可以抑制核酸酶对 DNA 的分解作用。
3. 实验步骤
   • 交联
     • 在细胞培养皿中加入甲醛，使终浓度达到 1% 左右，轻轻摇晃培养皿，使甲醛均匀分布，然后在室温下孵育 10 - 30 分钟。孵育结束后，加入甘氨酸溶液来终止交联反应，甘氨酸的终浓度一般为 0.125M 左右，继续孵育 5 分钟左右。
   • 细胞裂解和染色质片段化
     • 用预冷的 PBS（磷酸盐缓冲液）洗涤细胞两次，然后加入裂解缓冲液，将细胞收集到离心管中。在冰上孵育一段时间，一般为 10 - 30 分钟，使细胞充分裂解。之后可以采用超声破碎或者酶解的方式对染色质进行片段化。如果是超声破碎，将细胞裂解液置于超声仪中，根据超声仪的功率和细胞类型等因素调整超声参数，如超声时间、间隔时间、功率等，使染色质片段大小在 200 - 1000bp 左右。
   • 免疫沉淀
     • 将破碎后的染色质溶液进行预清除，即加入适量的无关蛋白（如 IgG）和琼脂糖珠，在 4℃下旋转孵育一段时间，一般为 1 - 2 小时，这样可以去除非特异性结合的蛋白和 DNA。然后加入特异性抗体，在 4℃下旋转孵育过夜。之后加入琼脂糖珠（已结合抗体），在 4℃下继续旋转孵育 2 - 4 小时，使抗体 - 蛋白质 - DNA 复合物与琼脂糖珠充分结合。
   • 洗涤和洗脱
     • 用不同的缓冲液对琼脂糖珠 - 复合物进行洗涤，以去除未结合的杂质。洗涤缓冲液的成分可以包括低盐缓冲液、高盐缓冲液、LiCl 缓冲液等，每种缓冲液洗涤的次数和条件可能会有所不同。洗涤后，用洗脱缓冲液将 DNA 从琼脂糖珠 - 复合物中洗脱出来，洗脱缓冲液一般含有 SDS 和 NaHCO₃等成分。
   • DNA 回收和分析
     • 对洗脱得到的 DNA 进行回收，可以使用 DNA 纯化试剂盒。回收后的 DNA 可以通过 PCR 检测是否存在与目标蛋白结合的特定 DNA 序列，也可以进行测序分析，如 ChIP - Seq（染色质免疫沉淀测序）来全面了解蛋白质 - DNA 相互作用的位点。
4. 实验注意事项
   • 交联过程中甲醛的浓度和时间要严格控制，以免产生过多非特异性交联。
   • 超声破碎时要注意避免过度破碎，因为这会导致 DNA 片段过小，影响后续分析。同时，不同细胞类型和超声仪可能需要不同的超声参数，需要提前进行摸索。
   • 抗体的质量和特异性对实验结果至关重要，在使用前最好进行验证。
   • 在整个实验过程中，要注意保持低温，尤其是在免疫沉淀和洗涤步骤，以减少非特异性结合和蛋白质 - DNA 复合物的解离。