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- 2026年04月22日
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一、RNA pull down的实验原理是什么？为什么要做RNA pull down？
RNA pull down使用体外转录法标记生物素RNA探针，然后与胞浆蛋白提取液孵育，形成RNA-蛋白质复合物。该复合物可与链霉亲和素标记的磁珠结合，从而与孵育液中的其他成分分离。复合物洗脱后，通过western blot实验检测特定的RNA结合蛋白是否与RNA相互作用。
蛋白质与RNA的相互作用是许多细胞功能的核心，如蛋白质合成、mRNA组装、病毒复制、细胞发育调控等。若待检测目的蛋白明确，选择Western blot鉴定；若不明确，则可选择质谱鉴定。
科沿有道现提供RNA pull down检测技术服务, 使用特异性二抗进行检测，能有效避免抗体重链对结果的信号干扰。并且科沿有道配套有先进的质谱仪，能显著提升检测效果。
二、除了RNA pull down外，还有哪些lncRNA研究的服务？
RNA pull down实验与LncRNA的研究是分不开的，为lncRNA生物学功能的验证起到了至关重要的作用。除此之外，科沿有道可提供的lncRNA研究服务包括：lncRNA在不同组织中表达水平的检测、lncRNA特点探究、lncRNA的功能研究、lncRNA结合蛋白质的检测、miRNA在lncRNA的作用靶点预测及功能验证、lncRNA表达调控的研究。
三、RNA pull down实验前富集LncRNA都有哪些方法？
LncRNA的富集大致上有三种方法:
1) 探针法：针对该LncRNA的序列，设计生物素标记的探针。此种方法最关键的是探针的特异性，所以最好用Northern Blot检测探针的特异性。可以结合内源的LncRNA是探针法的最大优势。缺点就是比较贵，需要的样品量大。
2) 生物素标记法：在LncRNA的5‘端加上T7启动子，利用体外转录试剂盒，可以制备大量的LncRNA。再通过生物素标记试剂盒，就能得到大量的生物素标记的LncRNA。常用的折叠的方法退火，从95℃退火到4℃，大约30秒一度就可以了。
3) TRSA法：除了生物素，链霉亲和素还可以识别TRSA结构，因此在LncRNA的一端加上TRSA序列也是不错的选择。
四、RNA pull-down是否可以做circRNA？
可以，前提是circRNA在细胞中表达丰度要高。
五、RNA pull down的实验有对照吗？
有，探针法和生物素标记法的对照都是相应的反义序列：探针的反义序列以及长非编码RNA的反义序列。TRSA法的对照是TRSA序列本身。
六、RNA pull down的实验如何防止RNA降解？
RNA pull down实验的一大难点就是RNA本身易降解，所以过程中要禁止RNase,以防止降解。因此在整个实验过程中除了EP管、枪头、镊子这些常用的器具需要灭菌，所有试剂均需要DEPC•H2O配置并灭菌！处理后的耗材需要尽快用掉，超过两周则需要重新处理。操作台需要用RNaseZAP擦净，以去除环境中的RNA酶的影响。
七、RNA pull down后银染，条带背景深是什么原因？
背景深需考虑是不是SDS-PAGE染色时间过长或者抗体的质量问题，多克隆抗体经常会出现这种情况，最有可能的情况是样品中包含的非特异性蛋白太多了，针对这一点，有以下解决措施：
1) 优化孵育时间、温度、盐浓度等条件；
2) 优化缓冲体系，使用严谨性高的缓冲体系；
3) 提高裂解液的质量。
八、RNA Pull-down拉下蛋白PAGE电泳银染条带颜色浅且模糊是什么原因？
可能的原因有以下几点：
1) 选取的组织或细胞样品其中互作蛋白表达量很低；
2) 体外转录得到的RNA降解或者不是全长；
3) Pull-down实验孵育时间不长。
九、RNA Pull-down拉下蛋白银染后看不到互作蛋白是什么原因？
可能的原因有以下几点：
1) 选取的RNA序列不对；
2) 样品中没有表达互作的蛋白质；
3) 互作蛋白浓度低，银染图肉眼观察不到差异条带。
十、RNA结合蛋白没有结合的可能原因和解决方案？
RNA结合蛋白没有结合，可能是因为靶蛋白量不足或者RNA探针和蛋白的亲和力本来就低，也可能缓冲体系不对。
解决办法包括有：
1) 增加上样蛋白量；
2) 应用低盐体系；
3) 加入交联试剂。
十一、RNA结合蛋白的亲和力不够的可能原因和解决方案？
可能原因：结合缓冲环境没有优化、裂解不完全、磁珠用量不足、RNA探针用量不足等。
解决办法：可优化孵育时间、温度、盐浓度等条件、增加裂解液和蛋白上样量的比例、适当改变磁珠及探针用量、增加裂解液、确定生物素和链霉亲和素效率等。
十二、RNA结合蛋白结合的非特异性高的可能原因和解决方案？
可能原因：
1)缓冲环境没有优化；
2)缓冲环境严谨性低；
3)样品没有裂解完全和裂解体系没有优化。
解决方法：
1)优化孵育时间温度盐浓度等条件；
2)使用严谨性高的缓冲体系；
3)调低RNA探针和样品的比例；
4)提高裂解液的量
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文献和实验做的是外参。外参可以最大限度地降低对限定造成实验的作用，适用于内参表达不稳定的外泌体或暂时未发现合适内参的其他样品，对目的microRNA进行相对定量，替代内参作用。部分文献或许可以类似于U6等作为内参。 16 、下游qPCR检测时C T值过高如何处理？ 答：外泌体RNA是微量的，首先样品准备阶段保证样品的质量和数量充足（例如血清建议新鲜样本准备2ml以上）。有实验表明，2ml血清样本提取的外泌体，qPCR检测U6（细胞样本microRNA内参存在）的CT值只有30+，基因CT值在30
处理样品的百分比。 绝对定量实验必须使用已知拷贝数的绝对标准品，必须做标准曲线。相对定量可以做标准曲线，也可以不做标准曲线。 相对定量实验有两种方法：标准曲线法和CT值比较法。如果使用标准曲线法，可以使用绝对标准品，也可以使用相对标准品，而且相对标准品在实验操作上更为简便易行。相对标准品是只知道样品中DNA或RNA的稀释比例而不需要知道其分子数目的标准品，典型的做法是将一个已知pg数的样品做一系列梯度稀释。 CT值比较法是利用CT值与起始DNA浓度的对数成反比的数学关系，来计算不同样本之间的相对
1. miRNA是什么？具有什么作用？ 答：microRNAs（miRNA）是一种内源性非编码小分子RNA，一般具有18到25个核苷酸，其序列在进化上高度保守，通过靶向特定mRNA来调节基因的表达。 miRNA是越来越受关注的转录后调控网络（post-transcriptional control）中重要的调控因子。首先，miRNA结合到核糖核蛋白（Ribonucleoprotein，RNP）复合物中，形成RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing
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