琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖凝胶电泳是凝胶电泳中最早使用的技术，但目前仍被广泛使用。琼脂糖凝胶电泳中的琼脂糖为半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷，是一种天然的聚合长链状分子，同时可形成具有刚性的滤孔。

一、琼脂糖凝胶电泳具有以下优点：

①对蛋白质吸附极微，故无拖尾现象。

②凝胶结构均匀，电泳区带整齐，分辨率高，重复性好；孔径较大，可用来分离酶的复合物、核酸。病毒等大分子物质。

③相与固相界面无明显界限，因此电泳速度快；

④不吸收紫外线，可以直接利用紫外光吸收法作定量测定；

⑤透明度较好，区带容易染色，样品易回收，利于制备。

带有digaoxin标记的三磷酸脱氧尿甘（dUTP）通过缺口翻译、随机翻译或PCR等反应而使探针核酸片段带有digaoxin，进一步可与带有AP、CSP等各种抗digaoxin抗体复合物发生免疫反应，使探针上带有AP等分子，催化化学或发光反应。

对于目的DNA 或RNA 来说，分子杂交后，杂交部分可通过 ELISA 实验程序加以检测，显示出杂交部分。

 

二、琼脂糖凝胶电泳的缺点：

1、机械强度差，易破碎。

2、强酸性物质，易造成电渗。

3、易被细菌污染，不易保存。

4、琼脂糖支持层上的区带易扩散。

 

三、琼脂糖凝胶电泳分离DNA原理

DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA分子量大小及构型不同，电泳时泳动率就不同。利用分子筛效应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系分出不同的区带，分离DNA。

溴化乙锭（Ethidium Bromide，EB）在紫外光照下发散荧光，同时，EB可与DNA分子反应形成复合物，该复合物的荧光强度与DNA的含量成正比。因此，可以根据荧光强度估计样品DNA浓度。

 

四、实验试剂及仪器

琼脂糖、溴化乙锭、电泳仪、电泳槽等。

 

五、实验步骤

1、配置琼脂凝胶电泳的缓冲溶液。常用缓冲溶液的pH值为6~9， 离子强度为0.02~0.05，离子强度不宜过高，否则会析出盐的结晶，甚至使琼脂板断裂而中断电源。

2、制板。通常琼脂浓度为1%~1.5%，此浓度下的凝胶常常富有弹性、坚固不脆。琼脂放入水浴加热至熔化，在此环境下与等体积预热至60℃的缓冲液混合，继续加热至表面无气泡后，迅速将凝胶倒在水平玻璃板上，厚度约为3mm，冷却即可。

3、电泳加样。可使用挖槽法，在琼脂板的中央挖一长方形小槽，将在水浴上熔化至42~45℃的琼脂与样品等量混合，倒入小槽中，也可直接将样品倒入小槽中；还可以使用滤纸插入法，在琼脂板上适当的位置用刀片切一裂缝，插入蘸有样品的厚滤纸片，纸片的宽度与琼脂板厚度一致。

4、调节电压，固定和染色将电泳后的琼脂板浸入70%酒精配制的2%醋 酸 溶液中15~20分钟进行固定。固定后的琼脂板，需用自上而下为水漂洗数次，然后放在40℃左右的烘箱中烘干，这时琼脂板成一薄膜，附于玻璃板上，再以适当的显色剂显色。

 

六、DNA迁移速率决定因素

1、DNA分子大小：双链DNA分子迁移的速率与其碱基对数的常用对数近似成正比；

2、琼脂糖浓度：浓度越低，相同核酸分子迁移越快；

3、DNA的构象（同一分子）：超螺旋环状＞线状＞切口环状；

4、凝胶缓冲液中所用试剂；

5、琼脂糖种类;电泳缓冲液;电压等其他因素。