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        质粒 DNA 琼脂糖凝胶电泳定量及定量检测

        丁香园

        11493

        [ 实验目的 ]

        通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 的方法和技术。

        [ 实验原理 ]

        DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。 DNA 分子在高于等电点的 pH 溶液中带负电荷,在电场中向正极移动。由于糖 - 磷酸骨架在结构上的重复性质,相同数量的双链 DNA 几乎具有等量的净电荷,因此它们能以同样的速度向正极移动。

        在一定的电场强度下, DAN 的迁移速度取决于分子筛效应,即 DNA 分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的 DNA 片段泳动速度不一样,可进行分离。 DNA 分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。

        凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的 DNA ,也可以分离相对分子质量相同,但构型不同的 DNA 分子。不同构型的 DNA 分子迁移率不同。 凝胶中的 DNA 可与荧光染料溴化乙锭 (EB) 结合,在紫外灯下可看到荧光条带,籍此可分析实验结果。

        [ 仪器、材料与试剂 ]

        (一)仪器

        1. 水平电泳槽

        2 .电泳仪

        3 .紫外灯或凝胶成像仪

        (二)材料

        1. 冰醋酸

        2. 三羟甲基氨基甲烷( Tris )

        3. 乙二胺四乙酸( EDTA )

        4. 溴酚兰

        5. 琼脂糖

        7. 甘油

        8. DNA 染料

        9. 吸头、小离心管

        (三)试剂

        6×DNA 电泳加样缓冲液:

        甘油 30%

        溴酚蓝 0. 25%

        Tris-Cl(pH8. 0) 70%

        4℃ 保存。 室温保存,用时稀释 5 倍。

        DNA 分子量标准: 200bp Ladder

        λDNA 分子量标准: 5ng/ul , 10ng/ul

        50×TAE 电泳缓冲液贮存液配方: (50×) 每升

        242g Tris

        57. 1ml 冰醋酸

        100ml 0. 5mol/L EDTA(pH8. 0)

             室温保存,用时稀释 50 倍。

        10mg/ml EB : 1. 0g 溴乙锭溶于 100ml 超纯水中。

        [ 实验步骤 ]

        (一)制备琼脂糖凝胶

        1 .称 1. 2g 琼脂糖,加 100ml 电泳缓冲液( 1×TAE )加热熔化,取出摇匀,即为 1. 2% 的凝胶。

        2. 当胶液冷至 60℃ 时,加 EB10μl ,小心混匀,缓慢倒入制胶模具中,在胶一端插上梳子。

        3 .待胶凝固后,拨出梳子,将模具置于电泳槽中,加入 1×TAE ,让液面高于胶面 2 -3mm 。

        4 .取 4ul 质粒,加 2ul lodaing buffer , 6ulddH 2 O ,混匀,用加样器吸取样品。加入点样孔中,注意加样器吸头应恰好置于凝胶点样孔中,不可刺穿凝胶,也要防止将样品溢出孔外。

        5 .接通电源, 1-5V/cm 电压,开始电泳。

        6 .当溴酚兰染料移动到距离胶前沿 1 -2cm 处,停止电泳。

        7. 切断电源后,取出凝胶,在紫外灯( 360nm 、 312nm 或 254nm )下或经凝胶成像系统观察或拍照。

        附注:

        影响 DNA 片段琼脂糖电泳的几个因素:

        1. DNA 分子的大小:线性 DNA 分子的迁移率与其分子量的对数值成反比。

        2. 琼脂糖浓度:一定大小的 DNA 片段在不同浓度的琼脂糖凝胶中的迁移率是不相同的。相反,在一定浓度的琼脂糖凝胶中,不同大小的 DNA 片段的迁移率也是不同的。若要有效地分离不同大小的 DNA ,应采用适当浓度的琼脂糖凝胶。

        质粒 DNA 琼脂糖凝胶电泳定量及定量检测

        3. DNA 分子的形态:在同一浓度的琼脂糖凝胶中,超螺旋 DNA 分子迁移率比线性 DNA 分子快,线性 DNA 分子比开环 DNA 分子快。

        4. 电流强度:每厘米凝胶电压不超过 5V ,若电压过高分辨率会降低,只有在低电压时,线性 DNA 分子的电泳迁移率与所用电压成正比。

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